锌掺杂羟基磷灰石纳米棒：兼具抗菌与成骨双重功能促进牙周再生

《Nano Select》：Zn-Doped Hydroxyapatite Nanorods With Dual Antibacterial-Osteogenic Functions for Periodontal Regeneration

本文综述了锌掺杂羟基磷灰石纳米棒（Zn-HAp NRs）作为一种新型牙周再生生物材料的研究进展。该材料通过简便的一步原位矿化法合成，不仅保持了羟基磷灰石（HAp）优异的生物相容性和骨整合能力，更因Zn2+的掺入而获得了显著的抗菌活性（尤其针对牙周致病菌P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans）和增强的成骨分化促进作用。研究表明，当Zn/(Zn+Ca)掺杂比为0.25时，材料在抗菌、促成骨（通过促进BMP2、OPN、RUNX2等基因和蛋白表达）及细胞相容性之间达到最佳平衡，展现出解决牙周组织再生中感染控制和骨缺损修复双重挑战的巨大潜力，为下一代牙周再生疗法提供了有前景的策略。

　　

1 引言

牙周病导致的牙槽骨丧失是口腔健康领域的重大挑战，其特点是持续炎症引发的软硬组织破坏，最终导致牙齿脱落。传统牙槽骨缺损再生方法因疗效和生物相容性欠佳而受限。自体骨移植曾是修复牙周骨缺损的“金标准”，但其存在供区损伤、发病率高、移植物吸收和感染等显著缺点，促使研究转向开发更优的人工替代材料。

口腔细菌，尤其以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）为代表，是牙槽骨修复失败的主要原因。细菌生物膜的形成和抗生素耐药性的出现，使得在牙槽骨修复过程中引入抗菌材料成为最有前景的策略之一。因此，兼具抗菌特性和生物安全性的牙槽骨组织工程材料设计成为当前研究热点。

羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HAp）因其与人体骨组织成分相似、具有卓越的生物相容性和生物活性，在骨组织工程和牙科应用中取得巨大进展。为获得更优的生物学性能，掺杂改性HAp被广泛研究。Zn²⁺因其是骨骼中的生理微量元素，参与蛋白质、碳水化合物和脂质代谢，并具有优异的杀菌性能（通常归因于膜破坏和干扰细菌代谢酶），而成为最有前景的掺杂剂之一。因此，本研究旨在开发并评估具有成骨和抗菌潜力的锌掺杂羟基磷灰石纳米棒（Zn-HAp NRs），用于牙槽骨再生。

2 材料与方法

本研究通过一步原位矿化法成功合成了Zn-HAp NRs。通过精确控制CaCl₂和ZnCl₂的投料比，设定了四种不同的锌离子掺杂比（Zn/(Ca+Zn)）：0、0.1、0.25和0.4。

采用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、动态光散射（DLS）、X射线衍射（XRD）和Zeta电位等技术对材料形貌、结构、尺寸分布和表面电荷进行了系统表征。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估了Zn²⁺的释放行为。

抗菌活性通过最小抑菌浓度（MIC）测定、结晶紫染色法评估生物膜抑制、细菌死活染色试剂盒评估细菌活性以及DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平来进行，主要针对牙周致病菌Pg和伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa）。

体外成骨分化能力通过茜素红S染色检测钙结节形成、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测成骨相关基因（BMP2、OPN、RUNX2）表达以及蛋白质印迹（Western Blot）检测相应蛋白（OCN、OPN、RUNX2）表达水平来评估。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测材料对小鼠胚胎细胞系3T3-L1和MC3T3-E1细胞活力的影响。通过溶血实验评估材料的血液相容性。

3 结果与讨论

3.1 Zn-HAp NRs的制备与表征

SEM分析显示，成功合成了纳米棒状结构的Zn-HAp材料。随着Zn²⁺掺杂浓度的增加，纳米结构的尺寸和形状发生明显变化，Zn²⁺比例越低，晶体越倾向于棒状，高浓度Zn²⁺掺杂的HAp尺寸减小、长度变短。EDS元素图谱和半定量分析证实Zn成功掺入HAp基质中，且分布均匀。随着标称Zn掺杂比的增加，Zn原子分数总体增加，而Ca原子分数减少，这与Zn部分取代HAp结构中的Ca相一致。

XRD结果证实成功合成了高纯度、良好结晶度的Zn-HAp NPs，Zn离子掺杂未改变HAp的六方晶体结构，但略微诱导晶格畸变和晶粒细化。值得注意的是，Zn/(Zn+Ca) = 0.4的颗粒结晶度显著降低，而Zn/(Zn+Ca) = 0.25的样品在确保有效离子释放行为的同时保持了令人满意的抗菌和成骨性能，更为优选。

Zeta电位测试表明，Zn²⁺的添加提高了HAp材料的电位，使其表面带正电，这有助于材料与带负电的细菌膜接触，破坏细菌细胞膜离子平衡。离子释放测定显示，Zn²⁺的累积释放量随材料中Zn掺杂比的增加而增加。Zn/(Zn+Ca)比为0.25和0.4的样品表现出更显著的释放动力学，其特征是在前12小时内初始快速释放，随后持续但较慢的释放长达48小时，这表明其具有相对稳定和延长的释放曲线，有望在较长时间内维持有效的抗菌浓度。

3.2 抗菌活性测定

MIC测定表明，未掺杂Zn²⁺的HAp抗菌性能不显著，而随着Zn²⁺浓度的增加，NRs表现出优异的杀菌性能。定量结晶紫实验证明，Zn-HAp NPs能剂量依赖性地显著抑制两种致病菌的生物膜形成。细菌死活荧光染色实验直观显示，随着Zn掺杂水平的增加，红色荧光（死菌）细胞比例显著增加，绿色荧光（活菌和死菌）细胞比例相应减少，直接证明了其增强的杀菌效果。DCFH-DA实验定量表明，Zn-HAp NPs处理可诱导Pg和Aa细胞内ROS水平剂量依赖性增加，表明其诱导了深刻的氧化应激。过量的ROS对细胞膜、蛋白质和核酸造成不可逆的氧化损伤，这是Zn-HAp NPs抗菌功效增强的关键机制。

3.3 成骨分化评估

茜素红S染色结果显示，与未掺杂Zn²⁺的组相比，用Zn-HAp NRs处理的3T3-L1和MC3T3-E1细胞中矿化结节数量增加，并且在Zn²⁺掺杂比为0.25时显著增加。RT-qPCR检测成骨标志物基因表达显示，与对照组相比，四个Zn-HAp NRs处理组中OPN、BMP2和RUNX2的表达水平均有所增加，且在Zn/(Zn+Ca)比为0.25时基因表达水平最高。Western Blot分析结果与之吻合，Zn/(Ca+Zn) = 0.25组显示出最深的蛋白条带和最高的OPN、OCN、RUNX2蛋白表达水平，表明其具有最强的成骨效应。

3.4 细胞活力影响与血液相容性

CCK-8法评估细胞活力显示，Zn²⁺的浓度对3T3-L1和MC3T3-E1细胞的活力有影响。当Zn²⁺掺杂比为0.4时，在所有测试浓度下，细胞活力与0掺杂组相比均出现统计学显著下降。溶血实验结果表明，阳性对照组（0.1% Triton X-100）出现明显溶血，而阴性对照组（生理盐水）和所有四个Zn-HAp实验组（各10 mg）均未出现明显溶血，上清液保持澄清，吸光度处于基线水平，表明在测试条件下Zn-HAp材料具有可忽略的溶血活性。综合考虑成骨特性、抗菌活性和细胞毒性，Zn²⁺掺杂比为0.25是更合适的选择。

4 结论

本研究通过简便的一步原位矿化法成功合成了Zn²⁺掺杂羟基磷灰石纳米棒（Zn-HAp NRs）。体外结果表明，与未掺杂的HAp相比，Zn²⁺掺杂显著增强了抗菌功效并促进了成骨分化，显示出Zn-HAp NRs在牙周骨再生相关应用中的潜力。通过系统筛选，确定了最佳锌掺杂比例。研究表明，在特定范围内增加锌含量可同时提高纳米颗粒的抗菌和成骨性能；然而，过高的锌浓度会损害生物相容性，这凸显了精确控制掺杂的重要性。在本实验条件下，Zn/(Zn+Ca)比为0.25在生物活性和安全性之间达到了最有利的平衡，产生了最强的成骨和抗菌联合效果。总体而言，Zn-HAp NRs可能有助于解决牙周再生中的关键挑战，包括有限的骨形成和感染风险。然而，需要进一步的体内研究来验证其在复杂牙周微环境中的再生功效、生物安全性和长期性能。