开发了一种新型多重PCR检测方法，用于特异性鉴定犬弓首蛔虫（Toxocara canis）、猫弓首蛔虫（Toxocara cati）和狮弓首蛔虫（Toxascaris leonine）在犬和猫体内的感染情况

《Veterinary Parasitology》：Development of a novel multiplex PCR assay for the specific identification of Toxocara canis, Toxocara cati and Toxascaris leonine in dogs and cats

本研究开发了针对犬弓首蛔虫（Toxocara canis）、猫弓首蛔虫（Toxocara cati）和大 ly蛔虫（Toxascaris leonina）的多重PCR检测方法，验证其单种检测灵敏度为102 copies/μL，三种联合检测灵敏度为103 copies/μL，并证实其良好的特异性与可靠性。该技术为犬猫蛔虫感染的诊断及人类弓首蛔虫病溯源提供了实用工具。

　　

丁小青|万少兵|于军婷|周佩|李守军

中国广东省广州市华南农业大学兽医学院宠物技术工程研究中心，邮编510642

摘要

寄生虫病是狗和猫常见的健康问题，其中蛔虫类线虫是主要的动物源性寄生虫之一。三种蛔虫类线虫——Toxocara canis、Toxocara cati和Toxascaris leonina——常感染这些动物。有效的诊断技术对于系统研究、流行病学分析和临床管理至关重要。本研究开发了一种多重PCR（mPCR）方法，可以同时特异性地识别这三种蛔虫类线虫。设计了针对保守线粒体区域的特异性引物。通过系列稀释的标准DNA样品评估了该方法?敏感性，并通过检测与Madin-Darby犬肾细胞系、Ancylostoma caninum、Dipylidium caninum、Trichinella spiralis和Escherichia coli的交叉反应来评估其特异性。使用从狗和猫中收集的60份临床样本来验证了该方法的可靠性。实验结果表明，该方法的检测限为：单一种类线虫为102拷贝/μL，同时检测三种线虫类线虫为103拷贝/μL。此外，该方法表现出良好的特异性和可靠性。它为诊断和监测狗和猫中的主要蛔虫类线虫感染提供了实用的工具，并有可能应用于人类弓形虫病的溯源。

引言

蛔虫病是一种具有公共卫生意义的动物源性寄生虫病，分布广泛且历史悠久（Cockburn等人，1975年；Harter等人，2003年）。在狗和猫中，Toxocara canis、Toxocara cati和Toxascaris leonina是最常见的种类，可引起疲倦、体重下降、呕吐和腹泻等症状。严重感染可能导致幼犬肠梗阻甚至死亡（Bauer等人，2024年；Bonilla-Aldana等人，2024年；Yang等人，2025年）。值得注意的是，T. canis和T. cati也是导致人类弓形虫病的主要病原体（Cho等人，2009年；Ma等人，2018年）。作为Toxocara物种的主要终宿主，狗和猫在流行病学研究中发挥着越来越重要的作用。全球范围内，血清学调查显示约19%的人类曾接触过Toxocara（Ma等人，2020年）。在卫生条件较差的热带和亚热带地区，该病的发病率尤其高。10岁以下的儿童由于接触土壤和卫生习惯差而属于高风险群体。感染后，幼虫可能迁移到其他组织，引发严重并发症，包括眼幼虫移行症（Karti等人，2024年；Mom?ilovi?等人，2025年）、内脏幼虫移行症（Slesak等人，2007年；Kuenzli等人，2016年；Bisterfeld等人，2024年）和神经弓形虫病（Caldera等人，2013年；Deshayes等人，2016年）。准确鉴定物种对于临床管理和公共卫生控制至关重要。

传统上，这些蛔虫类线虫的物种鉴定依赖于形态学特征，如成虫体型、颈部翼状结构、雄性尾部结构以及卵的大小和卵壳形态（Leutenegger等人，2023年；Haleche等人，2024年）。然而，这些特征在密切相关的物种之间经常存在重叠，从而限制了基于形态学的鉴别方法的可靠性（Zhu等人，2001年；Nametov等人，2025年）。PCR通过特异性扩增保守的遗传序列实现物种鉴定，已被广泛应用于病原微生物（包括病毒、细菌和寄生虫）的鉴定、分型和分类（Hao等人，2019年；Uakhit等人，2021年；Xiao等人，2022年；Luu等人，2024年；Bizot等人，2025年；Liang等人，2025年；Swangsri等人，2025年）。已经开发了几种基于PCR的方法，包括嵌套PCR和单重PCR，用于检测狗和猫中的这三种蛔虫类线虫（Jacobs等人，1997年；Wu等人，1997年；Zhu等人，1999年；Li等人，2007年；Durant等人，2012年；Wang等人，2018年）。然而，这些方法存在操作耗时的问题。尽管嵌套PCR可以提高检测灵敏度，但它需要两轮扩增，从而延长了实验时间。单重PCR主要用于检测单一蛔虫类线虫物种；但当需要同时区分多个密切相关的物种时，必须进行多次独立反应，增加了操作复杂性。为了解决这些问题，开发了一种多重PCR方法，用于同时检测T. canis、T. cati和Ta. leonina。

部分内容摘录

寄生虫和细菌菌株

T. canis、T. cati和Ta. leonina的样本来自华南农业大学教学动物医院中的狗和/或猫。Ancylostoma caninum、Dipylidium caninum和Trichinella spiralis则来自广东省的不同动物农场。

根据表1和表2中总结的形态学特征，在光学显微镜下鉴定出成虫和卵，这些结果仅用于初步筛查（Uga等人，2000年；Gibbons等人，2001年；Xue等人，

特异性引物设计

在ITS序列中，T. canis和T. cati之间的总体核苷酸相似度为77–83%，T. canis和Ta. leonina之间的相似度为63–78%，T. cati和Ta. leonina之间的相似度为70–73%（图1A）。进一步分析显示，T. canis和T. cati之间的区域相似度始终较高，约为90%；而T. canis和Ta. leonina之间的相似度变化较大，范围从10%到90%不等（图1C）。对于mtDNA序列，这三种蛔虫类线虫之间的总体相似度为

讨论

混合蛔虫感染的出现使临床诊断变得复杂。中亚的流行病学研究表明，狗同时感染T. canis和Ta. leonina，以及猫同时感染T. cati和Ta. leonina的情况较为常见。这些混合感染与更严重的胃肠道症状和生长迟缓有关（Safarov等人，2023年；Safarov等人，2025年）。然而，现有的基于PCR的方法在处理混合感染时存在技术限制，因为它们可能无法准确区分这些物种

伦理批准和参与同意

所有样本均在主人同意的情况下通过非侵入性方式从粪便中收集。

资金支持

本工作得到了中国广东省自然科学基金（2025A1515010900）的支持。

CRediT作者贡献声明

李守军：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。于军婷：方法学研究。周佩：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。丁小青：撰写初稿、方法学研究、实验设计。万少兵：方法学研究、实验设计。

致谢

我们感谢华南农业大学教学动物医院在本研究的人员招募和推进方面给予的支持。

出版同意

不适用。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者贡献

概念构思：P.Z.、S.J.L.；资金获取：S.J.L.；实验设计：X.Q.D.、S.B.W.；方法学研究：X.Q.D.、S.B.W.、J.T.Y.；监督：P.Z.、S.J.L.；初稿撰写：X.Q.D.；审稿与编辑：P.Z.、S.J.L.