《BIOMATERIALS RESEARCH》：Photocrosslinkable Chitosan Quaternary Ammonium Salt-Based Ternary Hydrogel with Fibroblast Growth Factor 21 for Diabetic Wound Healing
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本研究针对糖尿病伤口愈合困难这一临床难题，开发了一种基于甲基丙烯酰化壳聚糖季铵盐(CQS-MA)、明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)和I型胶原的三元复合水凝胶(G/C-CS@FGF-21)，该水凝胶通过紫外光交联制备并封装成纤维细胞生长因子21(FGF-21)。研究证实该水凝胶可协同发挥FGF-21的早期炎症调节作用、CQS的持续抗菌功能、GelMA的可调机械性能以及胶原的细胞粘附配体特性，在体外促进巨噬细胞向M2表型极化和成纤维细胞迁移，在糖尿病小鼠模型中显著加速伤口闭合、促进再上皮化和血管生成，为糖尿病伤口管理提供了有前景的治疗方案。
糖尿病已成为21世纪全球最严峻的健康挑战之一，其患病率从2000年的4.6%攀升至2021年的10.5%，全球患者超过5.37亿。糖尿病足溃疡作为最严重的并发症之一，每年影响约1860万人，给医疗系统带来沉重负担。高血糖环境导致慢性炎症反应异常、感染风险增加和生物力学缺陷，使得伤口难以从炎症期顺利过渡到增殖期，形成典型的难愈性溃疡特征：肿胀、疼痛和反复感染。
传统临床处理方式包括外科清创、负压伤口治疗、专用敷料和皮肤移植，但这些方法各有局限。负压治疗需要特殊设备和技术人员，增加经济负担；传统敷料如纱布、合成纤维布等存在渗出液吸收差、需频繁更换、透气性过强导致伤口脱水、移除时易造成机械创伤等问题；皮肤移植则面临供区发病、尺寸不匹配和感觉功能障碍等风险。
在这一背景下，生物材料因其保持湿润环境、高生物相容性和可生物降解等优势受到广泛关注。壳聚糖作为一种天然聚合物，具有固有的抗菌和抗炎特性，但其水溶性差和生物活性低限制了应用范围。壳聚糖季铵盐(CQS)作为化学修饰衍生物，显著改善了亲水性和抗菌效果，但仍存在凝胶化不理想、过度膨胀和细胞粘附能力减弱等问题。明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)具有快速凝胶化速率、机械强度和细胞粘附特性，但变性过程导致其丧失了胶原特有的三螺旋构象，这一结构对启动细胞信号通路和支撑细胞外基质(ECM)中的关键生物相互作用至关重要。
为解决这些挑战，研究人员开发了一种光交联壳聚糖季铵盐衍生物——甲基丙烯酰化CQS(CQS-MA)，通过紫外光引发CQS-MA与GelMA和I型胶原的共聚，构建了封装成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的三元复合水凝胶，命名为G/C-CS@FGF-21。FGF-21作为特定的FGF亚家族成员，不仅是葡萄糖和脂质稳态的有效代谢调节剂，还能调节巨噬细胞迁移、控制炎症过程和影响脂质代谢，通过PPARγ激活机制刺激内皮细胞血管生成，并通过SIRT1调节的自噬过程促进表皮细胞迁移和分化。
研究团队采用的关键技术方法包括：材料合成与表征（CQS-MA和GelMA的合成与核磁共振验证）、水凝胶制备与性能测试（流变学、机械性能、溶血率、扫描电镜、压缩测试、稳定性评估）、体外细胞实验（巨噬细胞RAW264.7和成纤维细胞L929的活死染色、CCK-8增殖、细胞划痕、免疫荧光、Western blotting）、转录组测序分析（RNA-seq、差异表达基因、KEGG/GO富集分析）以及体内动物实验（糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型的建立与组织学评价）。
材料表征显示成功合成了CQS-MA，核磁共振谱图中5.6-5.5 ppm和5.2-5.3 ppm处的共振峰对应甲基丙烯酰胺功能团的丙烯质子，1.9 ppm处的信号归因于甲基丙烯酰基中的甲基质子。三元复合水凝胶的前体溶液粘度显著增强，所有组别均表现出良好的血液相容性（溶血率<2.2%）。扫描电镜显示所有水凝胶配方均具有相互连接的多孔网络，平均孔径约为150 μm。压缩测试表明CQS-MA的加入显著提高了机械强度（G/C-CS@FGF-21组达12.30 ± 1.11 kPa），而稳定性实验显示在模拟糖尿病伤口环境的高胰蛋白酶条件下，水凝胶在80分钟内快速崩解，便于作为异物清除和封装生物活性因子的释放。
G/C水凝胶更好促进成纤维细胞生长的研究发现，含胶原的水凝胶特别是G/C2组（0.16 wt%胶原）显著加速了L929细胞增殖，细胞在G/C1和G/C2上第3天就出现明显伸长，而纯GelMA上的细胞到第7天才伸长。基因和蛋白表达分析显示，G/C2配方对KGF、IGF-1、VEGF-A和CD31标记物的诱导作用最强，Western blotting和免疫荧光分析进一步验证G/C2培养的细胞表现出最高的EGF、α-SMA和PDGFA蛋白水平。
FGF-21调控巨噬细胞分化和成纤维细胞迁移的实验表明，100 ng/μl FGF-21处理最能促进RAW264.7细胞中M2基因（CD163、IL-10）的上调和M1基因（iNOS、MCP-1）的下调，Western blotting和免疫荧光证实CD206和ARG-1增加而iNOS和IL-6减少。划痕实验显示100 ng/μl FGF-21在48小时内实现完全伤口闭合，qRT-PCR揭示该浓度最能上调皮肤再生基因（EGF、KGF、IGF-1）并同时抑制炎症介质MMP-9。
巨噬细胞在复合水凝胶上的独特转录谱通过RNA-seq分析揭示，G/C-CS@FGF-21组与G/C相比，FGFR1、ITGAL和IL17RA等增殖和迁移关键调节因子显著上调，而HYAL1、AIF4和ADM等炎症介质明显下调。KEGG富集分析显示炎症控制和免疫调节相关通路（趋化因子信号途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用）以及伤口修复相关机制（NOD样受体信号、Rap1转导通路）显著富集。Gene Ontology分析表明上调基因主要富集于免疫调节和ECM组织过程，而下调基因主要与化学应激和氧化应激反应相关。
G/C-CS@FGF-21水凝胶促进巨噬细胞分化的释放动力学显示FGF-21在第1天释放达到峰值，到第10天几乎完全释放。RAW264.7细胞培养实验证实，CQS-MA的加入显著降低M1相关基因表达同时升高M2相关基因，而FGF-21进一步增强了这种向修复性M2表型的转变。L929细胞实验表明CQS-MA对细胞生长影响可忽略，而FGF-21能增强细胞增殖，qRT-PCR和免疫荧光显示EGF、KGF和α-SMA协同上调，同时促炎细胞因子IL-6下调。
G/C-CS@FGF-21水凝胶促进糖尿病小鼠皮肤再生的体内实验显示，到第15天，G/C-CS@FGF-21组伤口完全愈合，而空白组、G/C组和G/C-CS组的愈合率分别为24.99%、21.87%和15.44%。组织学分析表明G/C-CS@FGF-21组伤口宽度显著窄于对照组，毛囊再生数量明显多于其他组，肉芽组织厚度也显著大于空白组。Masson染色和天狼星红染色显示G/C-CS@FGF-21组胶原积累显著增加，胶原纤维更有序。分子表达分析证实G/C-CS组促进从促炎(M1)向抗炎(M2)表型转变，而G/C-CS@FGF-21组进一步放大这种M2偏向，同时促炎标记物IL-6和TNF-α相对减少，TGF-β1、α-SMA、KGF等皮肤再生标记物以及PDGFA和CD31等血管生成相关标记物显著上调。
研究结论表明，通过CQS-MA与GelMA和I型胶原共聚制备的光交联多功能水凝胶，能有效驱动巨噬细胞从M1向M2表型转变，增强成纤维细胞增殖、迁移和关键伤口愈合基因表达，支持血管生成信号传导。在糖尿病小鼠模型中，G/C-CS@FGF-21水凝胶治疗显著加速伤口闭合，改善肉芽组织形成、胶原沉积和毛囊再生，调节局部炎症和再生标记物以利于组织修复。这种协同策略为促进糖尿病伤口修复的各个阶段提供了有前景的方案，展现出显著的临床转化潜力。该研究发表于《BIOMATERIALS RESEARCH》期刊，为糖尿病伤口管理领域的材料设计和治疗策略提供了重要参考。
