《Journal of Virology》：Enhanced rhLCV production in lymphoblastoid cell lines derived from rhLCV-infected cynomolgus macaque PBMCs
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本研究成功建立并优化了rhLCV高效生产细胞系cy-LCL111，证明食蟹猴对rhLCV易感且其B细胞可被永生化。EBV特异性中和抗体（nAbs）可交叉抑制rhLCV感染，凸显食蟹猴作为EBV疫苗和抗体评价替代模型的潜力，为EBV相关研究提供了重要平台。
摘要
爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）感染全球90%以上成人，可引发多种恶性肿瘤和自身免疫性疾病，但因宿主限制性无法感染常用实验动物。恒河猴淋巴隐病毒（rhLCV）作为EBV直系同源病毒，为研究提供了替代模型。本研究证明食蟹猴（Macaca fascicularis）B细胞可被rhLCV有效感染并永生化，成功建立高效产毒细胞系cy-LCL111，其病毒产量超越传统生产者LCL8664。EBV gHgL特异性单克隆抗体（mAb）AMMO1和gB特异性mAb 3A5可交叉抑制rhLCV感染。结果表明，食蟹猴rhLCV感染模型是评估EBV疫苗和抗体的理想替代平台。
引言
EBV属疱疹病毒科淋巴隐病毒（LCV）属，可永生化宿主B细胞并建立终身潜伏感染。由于缺乏易感动物模型，EBV疫苗和药物开发受阻。人源化小鼠和部分非人灵长类（NHP）虽可用于研究，但存在免疫系统不完整或伦理限制等问题。rhLCV感染恒河猴模型因病毒与EBV高度同源、感染途径相似（口腔传播）而被广泛应用。然而恒河猴资源紧缺，亟需拓展新模型。食蟹猴作为近缘物种，其淋巴细胞对rhLCV的易感性及转化潜力尚待系统验证。
结果
rhLCV生产与鉴定
通过透射电镜（TEM）和巢式PCR证实LCL8664细胞可持续产生具有典型疱疹病毒结构的rhLCV颗粒（图1E）。病毒基因表达谱显示潜伏期（EBNA1、EBNA2、LMP1、LMP2A）和裂解期（BZLF1、BMRF1、BALF4）基因均活跃表达（图1D）。
rhLCV拷贝数定量
基于BALF5基因建立实时qPCR法，实现病毒拷贝数快速定量（图1F-H）。五批病毒原液滴度达106.8-8.6拷贝/μL。该方法还可用于检测食蟹猴全血和唾液中LCV载量（图1I-J），血清学检测显示仅个体#264存在EBV糖蛋白交叉抗体（图1K-N），提示其可能为自然感染状态。
食蟹猴淋巴细胞易感性
rhLCV感染食蟹猴PBMC 7天后，巢式PCR与EBER原位杂交（ISH）均检测到病毒基因表达及细胞聚集（图2A-C），而EBV无法感染（图2D）。EBNA2序列比对证实新永生化细胞系（cy-LCL111/502/975）均源于rhLCV而非内源性cyLCV（图3）。
B细胞永生化与病毒生产优化
rhLCV成功诱导食蟹猴PBMC形成淋巴母细胞样细胞系（LCL），细胞中病毒拷贝数达12-393/细胞，其中cy-LCL111产量最高（图4D-E）。经40代培养后，细胞增殖稳定且保持高病毒产量（图4F-H）。流式细胞术显示，TPA/NaB诱导后cy-LCL111中裂解期蛋白BZLF1和gB表达显著提升（图5A-C），病毒产量达109拷贝/μL（图5D）。优化诱导条件发现，细胞密度5×106/mL、20 ng/mL TPA+3 mM NaB处理24小时为最佳方案（图5F-H）。
中和抗体抑制感染
EBV gB特异性抗体3A5和gH/gL特异性抗体AMMO1可结合cy-LCL111表面蛋白（图6E），并在体外完全抑制rhLCV诱导的B细胞永生化（图6F-I）。序列比对显示，EBV与rhLCV的gB、gH/gL、gp42等同源率超79%，且抗体表位高度保守（图7-8），而gp350同源性较低（53%）。宿主受体（CR2、EphA2、NRP1、HLA-DR）在人与食蟹猴间同源性达92%-98%（图9-10），支持跨物种感染机制相似性。
讨论
本研究首次系统证实食蟹猴作为rhLCV感染模型的可行性，并建立高效产毒细胞系cy-LCL111。qPCR法定量病毒滴度较传统转化试验更快捷，但需注意无法区分感染性病毒颗粒。EBV关键中和抗体可交叉抑制rhLCV感染，凸显该模型在评估EBV靶向药物方面的价值。未来需通过口腔接种实验验证体内感染过程，并筛选LCV阴性食蟹猴以避免内源性病毒干扰。
材料与方法
病毒生产采用TPA/NaB诱导LCL细胞，超速离心浓缩；感染实验以1×105PBMC接种病毒，半换液培养；抗体抑制试验中病毒与抗体预孵育后加至PBMC。检测方法包括巢式PCR、EBER-ISH、流式细胞术、ELISA及TEM成像。
