《Journal of Virology》：Protective efficacy of a genetically modified attenuated vaccinia virus Tiantan strain against monkeypox virus challenge in a small animal model
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本研究通过CRISPR-Cas9介导的同源重组技术，构建了缺失毒力基因（C12L-K2L和A45R）的减毒痘苗病毒天坛株（VTT）重组病毒rVTT△C12K2△A45。该病毒在CEF（鸡胚成纤维细胞）中保持良好复制能力，但在人源细胞（2BS、MRC-5、WI-38）中复制受限，且在小鼠神经毒性和兔皮肤损伤实验中显示安全性提升。免疫BALB/c小鼠可诱导针对VTT和MPXV（猴痘病毒）的中和抗体，攻毒实验表明能显著降低肺部和生殖器官的MPXV病毒载量，凸显其作为新型猴痘疫苗候选株的潜力。
猴痘疫情与疫苗研发背景
猴痘是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患传染病，世界卫生组织（WHO）分别于2022年和2024年两次宣布其为"国际关注的突发公共卫生事件"。痘苗病毒（VACV）作为天花疫苗，因其与MPXV存在交叉保护免疫而被用于猴痘预防。天坛株（VTT）曾在中国天花消灭行动中发挥关键作用，但其神经毒性限制了临床应用，需通过基因工程进一步减毒。
重组痘苗病毒的构建与筛选
研究基于CRISPR-Cas9介导的同源重组技术，以EGFP（增强型绿色荧光蛋白）为筛选标记，依次缺失VTT基因组中的C12L-K2L、C17L-K2L、C20L-K2L、B13R-B19R和A45R区域，获得重组病毒rVTT△C12K2-EGFP等。通过Cre/loxP系统切除EGFP后，得到无标记基因的重组病毒rVTT△C12K2和rVTT△C12K2△A45。测序证实目标区域成功被替换或缺失。
减毒特性评估
与亲本VTT相比，rVTT△C12K2△A45在多种细胞（HEK 293、Hep2、Vero）中形成更小空斑，且在2BS、MRC-5、WI-38等人源细胞中复制能力显著降低。神经毒性实验中，BALB/c小鼠颅内接种5×105PFU（空斑形成单位）的rVTT△C12K2△A45后无死亡，而VTT组（500 PFU）全部死亡。鼻内感染后，重组病毒组小鼠体重无显著下降，而VTT组体重损失达29%。兔皮肤损伤实验进一步证实其减毒特性。
免疫原性分析
小鼠肌肉注射两剂rVTT△C12K2△A45（1×108PFU）后，血清中检测到针对MPXV抗原（A35R、B6R、M1R、H3L）的特异性结合抗体，以及VTT和MPXV的中和抗体。缺失A45R基因显著增加了IFN-γ（干扰素-γ）分泌脾细胞数量，提示增强细胞免疫应答。中和抗体水平与接种途径相关，肌肉注射的GMT（几何平均滴度）为136.52，高于皮下注射（45.54）。
攻毒保护效果
颅内攻毒实验中，免疫组小鼠全部存活，而PBS（磷酸盐缓冲液）对照组全部死亡。MPXV攻毒模型中，免疫组小鼠肺部和生殖器官的病毒载量显著低于对照组，且皮下接种组在生殖器官中病毒清除更快。尽管肌肉注射诱导更高中和抗体，但皮下接种显示更快清除病毒，提示非中和抗体功能（如抗体依赖性细胞毒性）和细胞免疫在保护中起重要作用。
讨论与展望
与第三代疫苗MVA（改良安卡拉痘苗）相比，rVTT△C12K2△A45在Vero细胞中保留复制能力，更利于疫苗生产。其缺失区域（C12L-K2L和A45R）与MVA部分重叠，但宿主范围限制性较低。未来可通过鼻内或口服接种进一步提升免疫应答。本研究证实rVTT△C12K2△A45兼具安全性与免疫保护效力，为猴痘疫苗研发提供新候选株。
