猴痘病毒转录本免受APOBEC3编辑的RNA-seq证据研究

《Journal of Virology》：MPXV RNA-seq data provide evidence for protection of viral transcripts from APOBEC3 editing

本文通过分析猴痘病毒（MPXV）RNA-seq数据，揭示了2022年疫情毒株中出现的APOBEC3特征性突变（C→T/G→A）源于DNA水平变异而非RNA编辑。研究通过多维度证据（包括链方向标准化、突变功能影响、转录特征关联性、二级结构分析及跨数据集重叠验证）系统论证了这一结论，并指出APOBEC3A/3B是潜在驱动酶。该发现明确了APOBEC3在MPXV进化中作用于DNA层面的机制，为理解病毒-宿主互作提供了新视角。

　　

ABSTRACT

2022年爆发的猴痘病毒（MPXV）作为双链DNA病毒，与早期毒株相比出现了异常高频率的单核苷酸替换，且呈现明显的C→T和G→A转换偏倚，这与APOBEC3胞苷脱氨酶活性一致。尽管APOBEC3诱导的突变在DNA水平已被充分证实，但其对MPXV RNA转录本的影响尚不明确。本研究通过分析感染样本的RNA-seq数据发现，高频错配位点中APOBEC特征性替换的富集可能源于两种机制：RNA编辑热点或固定DNA突变。多项证据支持这些替换源于DNA水平突变，包括链方向标准化后仍存在大量G→A替换、替换对蛋白质编码序列的中性影响、缺乏与转录特征或RNA二级结构的关联性，以及与已知MPXV毒株基因组突变的重叠。核苷酸上下文分析表明APOBEC3A或APOBEC3B可能是DNA水平突变的驱动因子。

INTRODUCTION

猴痘病毒属于痘病毒科正痘病毒属，其2022年多国爆发毒株相比2018-2019年相关病毒出现约50个单核苷酸替换，其中大多数为TC（互补链GA）上下文中的C→T转换。这种APOBEC3家族特征性突变模式提示病毒可能进化出人际传播能力。APOBEC酶能结合RNA或单链DNA，催化胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。尽管MPXV基因组突变已被广泛研究，但病毒mRNA是否受APOBEC3影响仍存争议。本研究通过分析公共MPXV RNA-seq数据，探究APOBEC突变在病毒转录本中的存在与否及分子特征。

MATERIALS AND METHODS

从SRA数据库获取人源（PRJEB60728、PRJNA906618）及非人灵长类（PRJEB56841、PRJNA1183318）宿主的RNA-seq数据，以及人源DNA测序数据（PRJNA845087、PRJNA981509）。使用minimap2、STAR和BWA进行序列比对，通过BCFtools检测错配位点（短读长测序替换频率阈值设为1%）。利用RNAfold和RNAsselem分析二级结构，通过位置权重矩阵（PWM）建模APOBEC酶序列特异性，并采用β-二项分布模型评估APOBEC特征替换的富集程度。

RESULTS

APOBEC特征替换在MPXV转录本中高频出现

在47个样本中鉴定到569个潜在RNA编辑位点，APOBEC特征性C→T/G→A替换在TC/GA上下文显著富集（P= 7.09×10^?8）。这些替换主要集中于替换频率（SF）≥50%的高频位点（P= 3.75×10^?9），而中低频位点无富集现象（图1d-e）。

链方向分析支持DNA水平突变起源

链方向标准化后，人源数据中G→A替换比例从57.9%降至45.6%，但仍保持较高水平（图2a）。功能分析显示同义替换显著富集（人源P= 2.98×10^?3），非同义替换减少（人源P= 4.23×10^?3），符合DNA水平突变的中性进化特征（图2b）。

缺乏转录相关基因组特征关联

APOBEC特征替换在基因组中均匀分布（人源KS检验P= 0.44），与基因表达时序（早期/中期/晚期）无显著关联（人源χ²= 3.3, P= 0.5），且与转录起始位点（TSS）、终止位点（TES）和启动子区域无相关性（图3）。

二级结构无APOBEC热点模式

与已知APOBEC偏好作用于发夹环3′端胞嘧啶的规律不同，预测二级结构显示突变位点未富集于发夹环区域（图4a）。 inverted repeat（IR）区域分析亦无显著富集（人源DNA-seq P= 0.62），与既往报道矛盾。

跨数据集重叠验证DNA突变本质

人源RNA-seq研究间66%位点重叠，所有RNA-seq数据集与已知MPXV突变目录（Isidro et al.和O'Toole et al.）重叠率达58%（图4c-d）。剔除已知毒株固有突变后，仍检测到APOBEC特征突变富集（22/49, P= 2.19×10^?8）。

核苷酸上下文指向APOBEC3A/3B

三核苷酸语境中TCG/CGA motif占比最高（人源34%），PWM分析显示突变谱与APOBEC3A/3B特异性最匹配（图5a-b）。YTCA vs RTCA motif富集分析支持APOBEC3A主导作用（图5c），但表达谱显示宿主间APOBEC3A/3B表达存在异质性。

ADAR介导RNA编辑证据不足

虽检测到A→G替换富集（16/35样本），但缺乏编码链偏好及双链RNA区域富集，不符合ADAR编辑典型特征。

DISCUSSION

本研究通过多维度证据表明MPXV转录本中APOBEC特征替换主要反映DNA水平突变。病毒在胞质复制过程中产生的单链DNA中间体为APOBEC3A/3B提供作用底物，其突变特征体现了宿主防御机制与病毒进化的动态博弈。尽管不能完全排除低频RNA编辑可能性，但当前数据支持APOBEC3对MPXV的作用集中于基因组层面。该发现为理解痘病毒宿主适应机制及APOBEC家族功能分化提供了重要线索。