《mSystems》：Catabolism of acetosyringone and co-metabolic transformation of 2,4,6-trichlorophenol by a novel FAD-dependent monooxygenase
摘要
乙酰丁香酮（Acetosyringone, AS）作为木质素中典型的紫丁香基（Syrinyl, S）型单体，是研究微生物对S-木质素衍生芳香化合物分解代谢的模式化合物。本研究揭示了一条全新的AS分解代谢途径，该途径由一种先前未表征的FAD依赖型氧化还原酶（命名为AsdA）启动。与唯一已知的、涉及侧链修饰并转化为丁香酸的AS漏斗途径不同，AsdA催化芳香环的直接羟基化，这代表了一种机制上独特的进入中心代谢的入口。该酶的鉴定是通过对以AS为唯一碳源富集的细菌群落进行宏基因组和功能分析实现的。该群落主要由根际假单胞菌（Pseudomonas rhizophila）组成，并表现出对氯化污染物2,4,6-三氯苯酚（2,4,6-TCP）和2,6-二氯苯酚（2,6-DCP）的共代谢转化能力。随后的功能实验证实了AsdA促进AS和2,4,6-TCP转化的假说。利用从细菌分离株根际假单胞菌AS1衍生的生物传感器菌株进行的诱导实验证实了asd基因簇的AS特异性上调。对公共宏基因组的调查显示，asdA分布狭窄但在根际环境中富集，指出了其生态重要性。总之，本研究揭示了一条先前未被认识的AS转化途径，并鉴定出一种在木质素衍生芳香化合物分解代谢和环境污染转化中表现出双重功能的酶。虽然TCP降解的机制已较为明确，但负责将其转化为2,6-二氯对苯二酚的具体酶此前一直难以捉摸——这一知识空白现已被AsdA填补。
引言
木质素是一种高分子量芳香族杂聚物，是维管植物中丰富的结构组分。在微生物降解过程中，木质素会释放出众多酚类化合物。其大分子结构由芥子基/紫丁香基苯丙烷类似物（S-木质素）、松柏基/愈创木基苯丙烷（G-木质素）和对香豆基苯丙烷（H-木质素）组成。尽管木质素结构刚硬且难以降解，许多微生物仍能参与其降解过程。历史上真菌被认为是主要的木质素降解者，但近期研究强调了细菌的作用，它们利用多样化的酶机器解聚木质素并将其芳香单元作为碳源和能源进行代谢。然而，细菌降解木质素的研究仍处于初步阶段。多组学方法（如（宏）基因组学、（宏）转录组学）以及代谢组学分析有助于揭示与细菌木质素降解相关的诸多未知问题。
AS是一种来源于S-木质素的酚类化合物，S-木质素是硬木和其他维管植物中大量存在的结构聚合物。AS是典型的紫丁香基型单体，是研究S-木质素衍生芳香化合物微生物分解代谢的模式化合物。此外，AS作为信号分子在植物-细菌通讯中扮演关键角色。尽管其生态相关性和与各种芳香污染物（Aromatic Pollutants, APs）的结构相似性，AS的微生物降解途径仍仅被部分了解。少数被深入研究的S-木质素降解菌包括Sphingobium lignivorans SYK-6，其基因组编码参与芥子酸分解代谢的酶，如阿魏酰辅酶A水合酶/合成酶（FerA/FerB）、丁香醛脱氢酶（DesV）和四氢叶酸依赖性O-去甲基酶（DesA）。近期研究在Sphingobium lignivorans SYK-6中鉴定出AvcABCDEF分解代谢途径，该途径分别将乙酰香兰酮和AS转化为香兰酸和丁香酸。然而，AS及其他S-木质子结构的分解代谢可能涉及更多尚未描述的酶和途径。
重要的是，AS在结构上类似于氯酚（Chlorophenols, CPs），后者是广泛用于工业和农业应用的合成化合物，并被美国环境保护署列为优先污染物，因其具有持久性、毒性和生物累积能力。AS与其他天然酚类化合物及CPs的结构相似性意味着，能够降解木质素或其衍生物的酶也可能促进CPs的生物降解，这与共代谢假说一致。为探索这一联系，我们富集了一个能够利用AS作为唯一碳源的土壤细菌群落。由此得到的群落以根际假单胞菌（Pseudomonas rhizophila）为主，能够有效降解CPs，更具体地是2,4,6-TCP和2,6-DCP。其简单的分类学组成使其成为研究木质素降解相关基因和途径以及鉴定降解中间产物的理想模型。本研究揭示了根际假单胞菌AS1中一个先前未知的基因簇，该基因簇启动AS下游漏斗化过程并促进2,4,6-TCP的共代谢转化。
结果
污染物降解能力评估
通过将堆肥土壤接种到以AS为唯一碳源的无机培养基（Mineral Medium, MM）中进行富集培养，经过6个月23次传代，获得了一个命名为ASC12的简化群落。静息细胞实验表明，ASC12群落对选定的APs和CPs具有降解潜力。虽然二苯并呋喃、二苯醚、萘和2-CP的降解率在统计学上显著，但其相对降解率在48小时内低于10%。相比之下，2,4,6-TCP和2,6-DCP分别被降解了48%和35%。在单化合物实验中，苯酚被完全降解，更值得注意的是，2,4,6-TCP和苯酚均被完全降解，而2,6-DCP部分降解了46.6%。
群落结构与功能基因分析
对ASC12群落的16S rRNA扩增子分析显示其分类学复杂性低，与假单胞菌属（Pseudomonas）和甲基嗜甲基菌属（Methylotenera）相关的扩增子序列变体占主导地位。宏基因组测序组装出三个环状宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs），分别被分类为s__Pseudomonas_E rhizophila（对应NCBI分类中的Pseudomonas rhizophila）和s__Methylotenera_A versatilis_A（对应Methylotenera versatilis）。基于基因组覆盖度，假单胞菌与甲基嗜甲基菌成员的比例为2:1。利用构建的涉及S-木质素细菌分解代谢或CPs降解的基因自定义数据库（ASD_DB）进行BLASTP比对，发现最有潜力的基因命中均属于假单胞菌MAG，而在甲基嗜甲基菌MAG中未发现显著命中，这表明ASC12中的假单胞菌在AS降解以及CPs共代谢中起主要作用。
关键菌株分离与功能验证
通过在固体MM（含100 mM AS）上培养ASC12群落成员，分离得到一株纯培养物，命名为AS1。通过MALDI-TOF质谱和16S rRNA基因测序确认其属于根际假单胞菌（Pseudomonas rhizophila）。分离的P. rhizophila AS1菌株具有利用AS作为唯一碳源的能力。其在AS上生长时的静息细胞实验证实了该菌株在2,6-DCP和2,4,6-TCP降解中的作用。值得注意的是，CPs的降解仅在AS1在AS存在下培养时发生；在LB培养基上培养时未检测到降解，支持了CP降解对AS代谢的依赖性。
新型关键酶AsdA的鉴定与表征
通过克隆和功能筛选，发现只有一个携带基因ACNJA3_12680的克隆能够降解AS和2,4,6-TCP。该基因被注释为FAD依赖型氧化还原酶，命名为asdA（AS降解）。其氨基酸序列与来自Pseudomonas sp. WBC-3的对硝基苯酚4-单加氧酶（PnpA）有41%的相似性。系统发育树分析显示，AsdA与已知的FAD依赖型氧化还原酶形成不同的簇，可能代表一个新的系统发育分支。基因组区域比较分析显示，asdA及其邻近基因（命名为asd基因簇，包括asdB, asdC, asdD, asdE）的架构仅与少数假单胞菌（如Pseudomonas sp. Pf153, P. mediterranea）中的同源簇相似。
基因簇诱导调控机制
利用携带报告基因egfp（增强型绿色荧光蛋白）的AS1衍生生物传感器菌株（AS1/eGFP）进行的诱导实验表明，在所有测试的底物中，只有AS和苔黑酚（orcinol）能诱导egfp荧光。具体而言，在2 mM和3 mM AS条件下，生物传感器菌株的诱导率分别比野生型菌株高2倍和3倍。虽然苔黑酚也能诱导asd基因簇表达，但AS1既不能以苔黑酚生长，也不能在静息细胞实验中降解它，这表明asd启动子区域可能存在调控杂泛性，能够响应AS的结构类似物，即使它们不是AsdA的底物。
代谢产物鉴定与反应机制
通过LC-MS分析AS转化产物，在仅携带asdA基因的E. coli细胞样品中发现了一个分子量为m/z = 213.0771 [M+H]+的特征峰，其分子式被确定为C10H12O5。通过高分辨率MS/MS碎片分析，推断其结构为2,4-二羟基-3,5-二甲氧基苯乙酮（AS-OH），并且额外的羟基位于芳香环的邻位（2-位或6-位）。这表明AsdA作为FAD依赖型单加氧酶，通过直接羟基化AS的芳香环启动其转化。
对2,4,6-TCP转化产物的分析鉴定出两个主要特征峰。主要产物的m/z = 176.9558 [M-H]?，分子式为C6H4Cl2O2，通过MS/MS碎片分析和Metlin数据库匹配，被鉴定为2,6-二氯氢醌（2,6-dichlorohydroquinone, DCHQ）。第二个特征峰m/z = 191.9746 [M-H]?，分子式为C7H6Cl2O2，被推定为2,6-二氯-4-甲氧基苯酚（2,6-dichloro-4-methoxyphenol, DCMP），可能是DCHQ被表达宿主E. coli BL21(DE3)进行O-甲基化的次要产物。因此，AsdA作为FAD依赖型单加氧酶，启动了2,4,6-TCP的转化，生成DCHQ。
生态分布与底物特异性
对GTDB中假单胞菌科（Pseudomonadaceae）代表性基因组的筛查发现，asdA同源物分布非常有限。在沙锥鸟（Sandpiper）数据库包含的329个含有Pseudomonas rhizophila的宏基因组中，仅在9个宏基因组中检测到asdA，这些宏基因组主要来自马铃薯、番茄和烟草的根际环境。此外，在筛查的3508个根际和堆肥来源的宏基因组中，又发现了两个含有asdA的宏基因组。asdA阳性读数主要在与植物相关或有机质丰富的环境（根际和堆肥）中检测到。
对AS1菌株降解多种S-木质素结构类似物能力的评估显示，该菌株能显著降解多种测试化合物，包括AS、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸、芥子酸、香草酸和藜芦酸。然而，仅表达asdA的E. coli主要降解AS和香草醛，对其他测试化合物的代谢贡献有限，表明AsdA具有较高的底物特异性。
讨论
本研究描述了一种新型酶AsdA，它启动了AS的转化，该酶编码在一个可能负责将AS衍生的中间产物汇入下游代谢的基因簇中，对木质素周转和植物有机质分解具有更广泛的意义。与先前已知的唯一AS分解代谢途径（通过AcvABCDEF酶将AS生物转化为3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-3-氧代丙酸）不同，AsdA直接参与AS芳香环的羟基化。这与其启动APs共代谢降解的能力一致，因为芳香环的羟基化通常是此类降解的第一步。CPs，特别是结构与AS相似的2,4,6-TCP，被假设为这类分子。
本研究选择液体富集培养策略，并结合堆肥土壤作为接种源，成功分离得到一个分类学组成简化的细菌群落。宏基因组分析和后续培养鉴定出Pseudomonas rhizophila AS1是降解AS、2,4,6-TCP和2,6-DCP的主要类群，其利用的是先前未描述的FAD依赖型单加氧酶AsdA。对asd基因簇表达的高度特异性诱导，以及底物降解谱分析，进一步支持了AS1在S-木质素漏斗途径中的主导作用。有趣的是，苔黑酚也能诱导asd基因簇表达，但AS1不能以其生长或降解，这提示asd启动子区域可能存在调控杂泛性，能够感知AS的结构类似物，即使它们不是AsdA的底物。
除了P. rhizophila AS1，在ASC12群落中还检测到Methylotenera versatilis MT1。作为一种专性利用C1化合物的细菌，其在该群落中的主要生态功能可能是解毒AS分解产生的有害C1副产物（如甲醛、甲醇）。
通过非靶向LC-MS分析，证实AS在仅携带asdA的E. coli中被羟基化为AS-OH。而在携带整个asd基因簇的克隆中，未检测到额外的分析物，表明asd基因簇可能是一个候选操纵子，参与AS-OH的进一步转化，但完整的代谢途径仍有待阐明。
2,4,6-TCP转化的主要代谢物是DCHQ，这一反应被认为是2,4,6-TCP降解的初始步骤。检测到的次要产物DCMP可能源于表达系统E. coli对反应中间体的细胞解毒反应（如O-甲基化）。
asdA及其基因簇的同源物非常稀少，功能未知。AS1菌株能降解多种S-木质素结构类似物，而asdA表达仅对AS和香草醛降解有主要贡献，表明AsdA具有高底物特异性。Pseudomonas rhizophila基因组在数百个根际和堆肥宏基因组中被检测到，但asdA基因本身仅在极少数中被发现，表明asdA是一个稀有基因，可能因测序深度不足而在以往的宏基因组研究中被忽略。
总之，本研究描述了一个参与AS分解代谢的新基因簇的发现，该基因簇可能被整合到S-木质素的中心代谢中。我们描述了一个系统发育上独特的FAD依赖型单加氧酶AsdA，它通过直接羟基化其芳香环来启动AS转化。值得注意的是，AsdA还表现出双重功能，参与2,4,6-TCP的转化。虽然2,4,6-TCP的下游降解途径在几个类群中是已知的，但宏基因组研究至今缺乏负责将其转化为2,6-二氯对苯二酚的关键基因；这一关键空白现已被asdA的发现所填补。这一发现增强了我们对酚类化合物与环境污染物之间复杂关系的理解，并凸显了为木质素降解而进化的微生物酶通过利用其广泛的底物杂泛性和/或功能扩展而作用于CPs和其他人为污染物的潜力。
材料与方法
（此部分详细描述了实验中使用的化学品、溶液、引物、细菌群落富集方法、降解潜力筛选、宏基因组DNA提取与测序、基因功能验证、蛋白表达、系统发育分析、生物传感器构建、LC-MS分析以及生态分布分析等具体实验步骤和方法，确保了研究结果的可重复性和科学性。）
致谢
本研究得到了捷克科学基金会（项目号22-00132S）和捷克共和国教育、青年和体育部约翰·阿莫斯·夸美纽斯计划（项目号CZ.02.01.01/00/22_008/0004597）的资助。
