A群链球菌PerR通过Dpr协调铁锌稳态增强内皮细胞感染适应性的机制研究

《mSystems》：Group A streptococcal PerR coordinates iron and zinc homeostasis through Dpr, aiding in bacterial fitness during endothelial cell infection

本研究揭示了A群链球菌（GAS）过氧化物反应调节因子PerR在协调铁和锌稳态中的关键作用。通过构建ΔperR突变体，结合双RNA测序、内皮细胞感染模型及表型分析，发现PerR通过调控铁外排蛋白PmtA、铁锌螯合蛋白Dpr、锌获取系统（AdcR调节子）及锌外排蛋白CzcD，帮助GAS抵御宿主活性氧（ROS）应激及营养免疫中的锌限制，从而增强其在人内皮细胞内的生存与增殖能力。

　　

ABSTRACT

化脓性链球菌（A群链球菌，GAS）可引起多种临床并发症及侵袭性疾病。先前研究表明，GAS能在内皮细胞内生存，得益于与活性氧（ROS）诱导的LC3相关吞噬作用（LAP）吞噬体融合的溶酶体酸化不足。对于缺乏过氧化氢酶但产过氧化物的GAS而言，其通过过氧化物反应调节因子（PerR）调节ROS诱导的氧化应激及金属离子稳态。然而，PerR是否在感染过程中调控锌稳态尚不明确。本研究构建了GAS ΔperR同基因突变体，通过双RNA测序分析、内皮细胞感染模型、计算预测及表型表征，揭示了PerR在GAS内皮细胞内生存中的保护作用。ΔperR突变体对锌剥夺的敏感性表明，PerR可能通过PmtA的铁外排、铁锌螯合的铁蛋白样Dpr、AdcR调节子（adcA、adcAII、phtD）及锌外排（czcD）协调铁和锌稳态。研究还发现，野生型菌株及ΔperR突变体在内皮细胞的吞噬溶酶体GAS包含囊泡内遭遇锌限制，这种宿主锌饥饿严重降低了ΔperR突变体的生存率。结果表明，PerR通过Dpr介导的铁锌调节比以往认知更为重要，进而增强GAS侵袭人内皮细胞过程中的适应性。

INTRODUCTION

由人专性A群链球菌（GAS；化脓性链球菌）引起的链球菌感染涵盖多种严重程度的疾病。无症状或轻度咽炎和脓疱病患者可能通过飞沫和接触传播GAS。若未及时用抗生素治疗，轻度GAS感染可能恶化为严重侵袭性GAS疾病，如坏死性筋膜炎和链球菌中毒性休克综合征，二者死亡率均较高。GAS拥有多种免疫逃逸防御机制以实现成功感染。对于缺乏过氧化氢酶但产过氧化物的GAS，其需调节来自先天免疫反应的ROS诱导的氧化应激及宿主营养免疫的金属离子调节。营养免疫通过螯合和中毒微量元素（金属离子）在感染部位防御细菌。金属离子对促进酶活性、稳定蛋白质结构和促进细胞过程至关重要。在人体中，铁和锌是细胞中第一和第二丰富的微量元素。研究表明，铁和锌稳态在宿主防御细菌感染中起关键作用。然而，过量金属亦具危险性，可能产生氧化还原活性剂或通过形成金属蛋白的非同源金属结合导致功能异常。目前，针对GAS在内皮细胞（局部感染播散前的最后屏障）中对抗宿主先天免疫反应及金属离子调节机制的研究尚少。先前工作发现，侵袭性GAS在人内皮细胞内酸化不足的LC3相关吞噬体（LAPosome）内增殖，该吞噬体源自ROS相关的LAP。但GAS如何克服ROS诱导的氧化应激及免疫反应的金属应激仍不清楚。多项研究表明，GAS PerR参与氧化应激及金属离子稳态的调节。PerR调节子包含铁相关ROS解毒基因，部分基因启动子区具有Per box。这些基因编码Dps样过氧化物抗性及铁蛋白样蛋白（Dpr）、铁外排重金属转运P_1B-4型ATP酶（PmtA）、烷基过氧化物还原酶（AhpC）、NADH氧化酶（Nox1）/烷基过氧化物还原酶（AhpF）、谷胱甘肽过氧化物酶（GpoA）及超氧化物歧化酶A（SodA）。PerR调节子还包含锌稳态基因，部分属于GAS AdcR（锌感应MarR家族中的黏附能力调节因子）调节子，其启动子含AdcR motif以获取锌。此外，阳离子扩散促进因子家族锌输出蛋白（CzcD）也被发现是PerR调节子的一部分。先前对perR突变体的转录组分析仅使用cDNA微阵列且基于生长培养基而非细胞感染或动物模型。因此，本研究旨在探究PerR在感染过程中对铁相关ROS及GAS致病机制的分子机制，特别关注GAS对先天免疫反应及金属离子（铁和锌）稳态的防御。

MATERIALS AND METHODS

菌株与生长条件：GAS菌株NZ131（血清型M49）接种于含0.5%酵母提取物（TSBY）或5%羊血胰蛋白酶大豆琼脂，于37°C、5% CO₂培养20小时。过夜培养的GAS单菌落刷新至对数中期（OD₆₀₀=0.5–0.6）。ΔperR突变体（Km^r）及ΔperR::perR互补突变体（Km^rEry^r）培养基中添加相应抗生素。

突变体构建：通过同源重组和基因替换构建ΔperR缺失突变体，并验证其无极性效应。Δdpr突变体使用温敏穿梭载体（pCN143）构建。互补菌株通过将perR或dpr片段连入pTRKL2载体并转化获得。

过氧化氢挑战：对数中期GAS暴露于含H₂O₂（0、0.3、3 mM）的M200培养基30分钟，计算存活率。

内皮细胞感染模型：人微血管内皮细胞（HMEC-1）培养于M200培养基，感染复数（MOI）为50。感染后1小时和5小时收集细胞，通过低渗裂解测定存活GAS菌落形成单位（CFU）。

免疫荧光显微镜分析：使用LysoTracker（酸性pH指示剂）或FluoZin-3 AM（锌染色染料）染色，结合抗LC3、抗LAMP-1及抗GAS抗体，通过共聚焦显微镜观察GAS包含囊泡的酸化及锌分布。

生长曲线分析：GAS接种于含H₂O₂、ZnSO₄或锌螯合剂TPEN的TSBY肉汤，每30分钟测定OD₆₀₀。

RNA分离与测序：从感染HMEC-1细胞中共分离总RNA，经核糖体RNA去除后构建文库进行双RNA测序。差异表达基因（DEGs）通过DESeq2分析，GO富集分析使用Blast2GO工具。

PerR蛋白纯化与EMSA：PerR蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）检测PerR与启动子DNA的结合。

细胞内金属离子测量：GAS菌体经硝酸消化后，通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定铁锌含量。

流式细胞术与Western blot：CM-H₂DCFDA染色检测细胞ROS，Western blot分析Dpr蛋白表达。

数据可视化与统计：使用R包及GraphPad Prism进行图表绘制和统计学分析。

RESULTS

GAS perR破坏增强H₂O₂耐受但降低HMEC-1细胞内生存

ΔperR突变体验证无误且无极性效应。在TSBY及3 mM H₂O₂中，各菌株生长速率相似，但ΔperR突变体在3 mM H₂O₂挑战下存活率更高。cDNA-qPCR显示PerR通过抑制dpr、ahpC、ahpF及sodA调节H₂O₂诱导的ROS应激。在HMEC-1细胞中，WT感染后LC3⁺GAS包含囊泡酸化不足，GAS在1至5小时增殖7.2倍；而ΔperR感染后囊泡充分酸化，CFU仅增2.4倍，表明HMEC-1细胞限制了ΔperR生长。

ΔperR突变体转录组谱

双RNA测序发现22个DEGs（10个上调、12个下调）。GO富集显示上调基因多与金属离子结合相关，下调基因主要参与羧酸生物合成。qPCR验证dpr、pmtA、adcA、adcAII及phtD在ΔperR中显著上调，czcD下调。启动子分析显示dpr和pmtA含Per box，EMSA证实PerR直接结合这些启动子，而adcA启动子无Per box结合。

GAS ΔperR面临铁耗竭、ROS应激、Dpr过表达及铁锌适应

ICP-MS显示ΔperR胞内铁含量显著低于WT，锌含量无变化。流式细胞术检测到ΔperR感染HMEC-1细胞后ROS生成增加。Western blot显示ΔperR感染细胞中Dpr表达更高。生长曲线及琼脂斑点试验表明ΔperR对锌中毒适应性增强，但对锌剥夺（TPEN处理）更敏感。

Dpr表达促进GAS锌储存

Dpr蛋白序列及结构分析表明其作为铁锌储存库。Δdpr突变体在HMEC-1细胞内增殖与WT相当，但锌获取基因表达变化不明显。在含0.8 mM ZnSO₄的TSBY中，WT及Δdpr生长受抑，而Dpr过表达的ΔperR、WT(pDpr)及Δdpr(pDpr)生长良好，表明Dpr可结合锌助GAS适应锌中毒。

GAS在内皮细胞囊泡内遭遇锌剥夺

免疫荧光显示LC3⁺LAMP-1⁺囊泡内锌信号微弱，WT与ΔperR均面临锌限制，可能导致ΔperR生存率降低。

DISCUSSION

本研究证实PerR调节子通过协调铁锌稳态增强GAS在内皮细胞中的适应性。ΔperR中持续表达的PmtA和Dpr导致胞内铁耗竭及锌获取竞争，引发轻度锌剥夺，进而增强锌获取并减少锌外排。内皮细胞囊泡内的锌限制加重ΔperR的生存压力。PerR通过铁外排、Dpr铁锌螯合及AdcR调节子精细调控金属稳态，其机制比既往认知更为关键。研究为理解GAS对抗先天免疫及开发抗GAS疗法提供了新视角。