从Agave salmiana中分离出的三种内生假单胞菌（Pseudomonas putida）的完整基因组，采用Illumina和PacBio测序技术进行组装

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genomes of three endophytic Pseudomonas putida isolates from Agave salmiana, assembled using Illumina and PacBio sequencing

本研究首次完整测序了来自龙舌兰（Agave salmiana）的三个内生假单胞菌（Pseudomonas putida）菌株PP_P5、PP_P9和PP_P43的基因组，基因组大小分别为6,282,325 bp、6,511,513 bp和6,284,694 bp。采用Illumina NovaSeq和PacBio HiFi测序平台，结合Hifiasm和Pilon进行组装与 polished，得到三个闭合染色体基因组，验证了物种鉴定并提供了详细的基因组特征数据。

　　

摘要

我们报告了从Agave salmiana中分离出的三种内生Pseudomonas putida菌株的完整基因组序列，这些序列是使用Illumina NovaSeq和PacBio HiFi测序技术获得的。基因组大小分别为6,282,325 bp（PP_P5）、6,511,513 bp（PP_P9）和6,284,694 bp（PP_P43）。

公告

Pseudomonas属细菌是广泛存在于植物中的微生物，其中一些菌株作为内生菌在促进植物生长、增强抗逆性和生物控制方面具有潜在作用。此前已有研究表明内生Pseudomonas菌株存在于龙舌兰属植物中，这凸显了它们在植物生理学中的重要意义及其潜在价值（参考文献1–3）。在此，我们报告了从Agave salmiana中分离出的三种Pseudomonas putida菌株的完整基因组序列，这些序列是通过Illumina NovaSeq和PacBio Sequel平台进行测序的。这是首次报道从龙舌兰属植物中分离出的内生Pseudomonas菌株的完整基因组序列。这些菌株的特征分析为未来研究龙舌兰与内生菌之间的相互作用以及微生物接种剂的开发提供了基础数据。

这些内生Pseudomonas菌株是从一株成熟的（5-6年生）A. salmiana植物的花序轴（即中心叶片周围的区域）中分离得到的，采样地点位于墨西哥莫雷洛斯州的乌伊蒂萨拉克（坐标：19°01′42″N 99°16′02″W），具体方法参照了先前的研究（参考文献4）。培养在添加了0.5 μg/mL环己酰胺（Sigma）的DIFCO Tryptic Soy Agar培养基上的菌落通过划线平板法进行纯化，并进行了革兰氏染色。分离出的菌株被保存在40%甘油溶液中，置于-70°C条件下。细菌DNA的提取是根据制造商的说明（QIAGEN公司，德国希尔登）使用DNeasy UltraClean Microbial Kit从30°C下的DIFCO Tryptic Soy Broth培养物中 overnight 后获得的。DNA的质量通过1%琼脂糖凝胶电泳进行了验证。

每种菌株的10微克基因组DNA被送往Novogene有限公司（加利福尼亚州萨克拉门托市），用于文库构建、质量控制和Illumina NovaSeq X Plus系列及PacBio Sequel II/IIe系统的测序。Illumina测序用的基因组文库是使用Rapid Plus DNA Library Prep Kit（ABclonal）按照制造商的标准协议制备的；PacBio HiFi文库则是使用SMRTbell Prep Kit 3.0（Pacific Biosciences）按照制造商的标准协议制备的。

Illumina NovaSeq测序分别为PP_P5、PP_P9和PP_P43菌株产生了9,946,938、14,183,022和12,977,976对末端序列。PacBio Sequel测序分别为这些菌株产生了3,757,916,046、3,728,124,989和4,261,168,756 bp的HiFi序列。读段质量使用FastQC v0.12.1（参考文献）进行评估；PacBio读段质量使用NanoPlot v1.46.1（参考文献<5>）进行评估。Illumina读段经过标准的质量控制工具处理和筛选后，使用Pilon v1.24（参考文献<6>）进行组装；PacBio HiFi读段则使用Hifiasm v0.25.0（参考文献<7>）进行组装。最终，结合修剪和筛选后的Illumina读段，PP_P5获得了6,282,417 bp的单一contig，PP_P9获得了6,317,734 bp的单一contig，PP_P43获得了6,284,694 bp的单一contig。

基因注释使用了NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（参考文献<8>）完成。物种鉴定通过BLAST v2.11.0（参考文献<9>）确认为Pseudomonas putida。组装质量使用QUAST v5.2.0（参考文献<10>）和NCBI中的P. putida参考基因组GCF_000412675.1进行评估。表1总结了所有基因组的组装结果。除非另有说明，所有软件工具均使用默认参数运行。

表1

表1 从Agave salmiana中分离出的内生Pseudomonas putida菌株的基因组组装信息

菌株	PacBio原始读段数	PacBio N50长度（bp）	Illumina原始读段数	SRA编号	总组装长度（bp）	覆盖度	总CDS区域	GC含量（%）	Contig/复制子	GenBank编号	Contig长度（bp）
PP_P5	220,325	17,497	9,946,938	SRX30911656	6,282,417	598.16×	5,620	62.12	Contig_1/闭合染色体	JBRUQK000000000	6,282,417
PP_P9	217,087	17,716	14,183,022	SRX30911658	6,317,734	572.54×	5,867	61.97	Contig_1/闭合染色体	JBRUQJ000000000	6,317,734
PP_P43	248,702	17,381	12,977,976	SRX30911660	6,284,694	678.02×	5,616	62.12	Contig_1/闭合染色体	JBRUQI000000000	6,284,694

致谢

这项工作得到了UNAM-PAPIIT IN227023项目的支持。

我们感谢Salvador Cueto先生提供的龙舌兰采样设施，以及WinterGenomics的Karla Ruiz和Violeta Larios在技术上的协助。同时，我们也感谢NCBI SRA工作人员在PacBio读段元数据处理方面给予的帮助。