双CRISPR/Cas驱动的无扩增表面增强拉曼散射生物传感器与智能手机结合，可实现总细菌数和活细菌的同时检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Dual CRISPR/Cas-driven amplification-free surface-enhanced Raman scattering biosensor combined with a smartphone for simultaneous detection of total and live target bacteria

CRISPR/Cas12a-Cas13a双系统SERS生物传感器实现活菌与总菌同步检测，灵敏度为~10 CFU/mL，结合手机拉曼设备可在45分钟内完成现场快速诊断，成功应用于金黄色葡萄球菌和Cronobacter sakazakii检测。

　　

乔瑞宝|倪群|赵瑞瑞|朱晓凡|王丽霞|焦静然|江涵|吴倩|姚双|姚莉|刘凯勇|秦攀珠

中国安徽省桐陵市桐陵人民医院实验室医学部，邮编244000

摘要

同时检测目标细菌的总数和活菌数量非常重要，但同时也具有挑战性。为了解决这一挑战，我们提出了一种基于CRISPR/Cas系统的无扩增表面增强拉曼散射（SERS）生物传感器，称为cc-SERS。该生物传感器的原理在于：细菌死亡后，DNA保持稳定，而某些RNA会迅速降解。简而言之，活菌中的目标DNA和RNA可以激活CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a，而死菌只能通过目标DNA激活CRISPR/Cas12a。在没有目标细菌的情况下，CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a都无法被激活。因此，由目标DNA激活的CRISPR/Cas12a产生的特征拉曼信号（1079 cm^-1）表明目标细菌的存在（包括死菌和活菌），而由目标RNA激活的CRISPR/Cas13a产生的特征拉曼信号（593 cm^-1）表明存在活菌。凭借这种独特的信号模式，该生物传感器能够在单个试管中同时检测目标细菌的总数和活菌数量，检测限约为10 CFU/mL。通过引入快速预处理程序和智能手机辅助的便携式拉曼光谱仪，整个过程可以在现场45分钟内完成。由于CRISPR/Cas系统的出色可编程性，该生物传感器已成功应用于金黄色葡萄球菌和Sakazakii克罗诺杆菌的检测。这项工作为同时检测目标细菌的总数和活菌数量开辟了一条有前景的途径。

引言

每年有数亿人受到病原菌引起的食品污染和疾病的威胁（Murray等人，2022年；Wang等人，2022年），这对全球公共卫生构成了严重威胁。及时筛查传染性细菌对于保护人们的生命和健康至关重要。目前，金标准培养方法可以提供关于病原菌的详细信息，但其耗时且劳动密集的特点使得它们无法满足日益增长的现场检测需求（Peng等人，2024年；Tozzoli等人，2019年）。虽然替代方法如ELISA（Wang等人，2023年）、侧向流动测定（LFA）（Xiong等人，2021年）、qPCR（Zhang等人，2023年）和LAMP（Yan等人，2023年）可以将检测时间缩短至几小时甚至几分钟，但它们无法提供关于活菌的详细信息。值得注意的是，在食品污染事件中，活菌往往是真正的感染原因（Wu等人，2024年；Xue等人，2022年）。目标细菌的总数可以反映其初始污染水平，而活菌的数量则表明灭菌后的感染风险（Xie等人，2025年；Zhang等人，2025年）。在临床实践中，总细菌计数表明消除前的交叉污染风险，而零活菌计数意味着消毒完成。此外，由活菌或死菌引起的疾病可能需要不同的治疗策略。因此，探索能够同时检测目标细菌总数和活菌数量的新筛查方法具有重要意义。

迄今为止，已经提出了一些基于细菌代谢物的活菌检测方法，例如基于ATP的方法（Zheng等人，2025年）和H₂S的方法（Gahlaut等人，2019年）。然而，这些方法大多无法识别特定的细菌种类，因为这些代谢物可能存在于不同的细菌中。另一种方法是结合核酸扩增技术和丙胺单氮化物（PMA）（Guo等人，2021年；Lv等人，2020年；Trieu和Lee，2019年）。虽然这种方法具有高灵敏度和特异性，但需要额外的PMA处理时间。此外，复杂食品基质对PMA扩散的限制可能导致假阳性结果。与在活菌和死菌中都保持稳定的基因组DNA不同（Xue等人，2022年），大多数RNA（如mRNA）在细菌死亡后会迅速被环境中的核糖核酸酶降解（Zhuang等人，2024年）。因此，可以通过特定RNA的水平来量化活菌的数量（Zhang等人，2021年）。鉴于此，近年来越来越多的研究致力于开发基于细菌RNA的策略。例如，RT-PCR和RT-LAMP已被证明能有效检测活菌（Niikura等人，2021年；Yuan等人，2020年）。然而，这些方法需要耗时的纯化步骤以避免同源基因组DNA的干扰。此外，非特异性扩增和气溶胶污染的风险通常是不可避免的（Zhang等人，2021年）。鉴于细菌死亡后DNA保持稳定而某些RNA迅速降解的特性，我们期望构建一种无需扩增的生物传感器，利用细菌DNA和RNA作为生物标志物来实现目标细菌总数和活菌的数量的同时检测。

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌适应性免疫系统的重要组成部分，能够特异性识别目标核酸，并在CRISPR RNA（crRNA）的辅助下表现出切割活性（Li等人，2025a；Wang等人，2024a）。通过将CRISPR/Cas系统与电化学（Dong等人，2023年）、表面增强拉曼散射（SERS）（Ma等人，2023年；Zhao等人，2025年）、LFA（Marsic等人，2021年）和微流控技术（Li等人，2024年）结合，已经构建了多种无需扩增且灵敏的生物传感器。令人鼓舞的是，目标DNA激活的CRISPR/Cas12a系统可以随机切割单链DNA（ssDNA）报告分子，而目标RNA激活的CRISPR/Cas13a系统可以切割单链RNA（ssRNA）报告分子（Yin等人，2024年）。此外，现有证据表明这两种CRISPR/Cas系统可以在同一试管中独立工作（Gootenberg等人，2018年；Guk等人，2023年；Li等人，2025b；Zhong等人，2025年）。基于以上考虑，我们设想开发一种新型生物传感器，分别利用CRISPR/Cas12a和Cas13a特异性识别细菌DNA和RNA。

在这项工作中，我们提出了一种基于CRISPR/Cas系统的无扩增SERS生物传感器（cc-SERS），并结合了智能手机辅助的便携式拉曼光谱仪，用于同时检测目标细菌的总数和活菌数量。为了实现双重SERS检测，我们使用了（4-氨基硫酚（4-ATP）和Nile blue perchlorate A（NBA）作为信号分子，因为这两种信号分子之间不存在交叉干扰（Jiang等人，2025年）。用不同信号分子（4-ATP和NBA）修饰的银壳金纳米颗粒（Au@Ag）与硫醇化DNA探针（SH-probe 1和SH-probe 2）结合，形成SERS标签（Au@Ag-probe^4-ATP和Au@Ag-probe^NBA）（图1A）。同时，生物素化的单链DNA（bio-ssDNA）和生物素化的单链RNA（bio-ssRNA）与链霉亲和素磁珠（SA-MB）共孵育，制备MB探针（图1B）。在没有目标细菌的情况下，失活的CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a无法切割MB探针表面的bio-ssDNA和bio-ssRNA，从而使Au@Ag-probe^4-ATP和Au@Ag-probe^NBA被MB探针捕获和分离。因此，在上清液中未检测到SERS信号（图1C）。在存在死菌的情况下，目标DNA（T-DNA）激活的CRISPR/Cas12a可以切割MB探针表面的bio-ssDNA。在这种情况下，只有Au@Ag-probe^NBA被MB探针捕获和分离，而Au@Ag-probe^4-ATP留在上清液中并产生特征拉曼信号（1079 cm^-1）。在存在活菌的情况下，T-DNA激活的CRISPR/Cas12a和T-RNA激活的CRISPR/Cas13a分别切割MB探针表面的bio-ssDNA和bio-ssRNA。这导致Au@Ag-probe^4-ATP和Au@Ag-probe^NBA都留在上清液中，并在1079 cm^-1和593 cm^-1处产生特征拉曼信号。由于T-DNA存在于活菌和死菌中，而T-RNA仅存在于活菌中，T-DNA浓度代表活菌和死菌的总数，而T-RNA浓度反映活菌的数量。为了证明cc-SERS的优异性能，我们在下面提供了详细的证明。

材料与试剂

四水合氯金酸（HAuCl₄?4H₂O）购自Sigma-Aldrich。基因组DNA提取试剂盒、细菌总RNA纯化试剂盒、一步提取缓冲液、柠檬酸钠（Na₃Cit）、L-抗坏血酸、T7 RNA聚合酶、dNTP混合物（25 mM）、NTP混合物（25 mM）、DNase I和PEG 20000购自Sangon Biotech（中国上海）。NBA购自BoMei Biotech（中国合肥）。4-ATP由Macklin Biochemical（中国上海）提供。Cas12a蛋白...

双重CRISPR/Cas驱动的金黄色葡萄球菌总数和活菌同时检测的验证

为了验证双重CRISPR/Cas驱动的荧光测定法是否可用于同时检测目标细菌的总数和活菌数量（图1A），分别设计了针对金黄色葡萄球菌的femA基因的CRISPR/Cas12a系统和针对femA基因mRNA的CRISPR/Cas13a系统（表S1）。使用ssDNA报告分子（FAM/BHQ1，λ_em= 520 nm）和ssRNA报告分子（Cy3/BHQ2，λ_em= 570 nm），参考了之前的研究（Guk等人，2023年）。正如预期的那样...

结论

总结来说，我们开发了一种基于CRISPR/Cas系统的无扩增SERS生物传感器（称为cc-SERS）。该生物传感器能够同时检测目标细菌的总数和活菌数量，这是传统培养方法、qPCR方法和大多数现有生物传感器无法实现的。该生物传感器消除了额外的预扩增步骤的需求，操作简单，从而避免了对热循环仪的依赖。该生物传感器已成功用于金黄色葡萄球菌的检测。

CRediT作者贡献声明

倪群：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据分析、调查、验证。赵瑞瑞：验证、监督、方法学、数据分析。朱晓凡：验证、调查、数据分析、可视化。王丽霞：资源获取、调查。刘凯勇：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、资金获取。秦攀珠：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2022YFF1102900）、安徽省自然科学基金（2308085QC112）、安徽省临床医学研究转化专项基金（202427b10020076）、安徽医科大学的科学研究水平提升计划（2022xkjT007）以及安徽医科大学公共卫生学院的Eagle计划指导团队的支持。