《Bone》：Sclerostin-targeted delivery of PCSK9 siRNA reverses osteoporosis in OVX mice
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本研究发现PCSK9在雌激素缺乏性骨质疏松小鼠中显著上调，基因敲除可改善骨微结构并增加骨量2倍。基于外泌体的靶向递送系统可有效沉默骨髓PCSK9表达，逆转骨丢失。
吴红玲|黄丽媛|宋芳芳|周月丽|吴彦茹|郑吉奇|尹正荣|魏艳阳|孙华玲|崔黄
中国武汉大学口腔医学院及医院，教育部口腔生物医学重点实验室，湖北省口腔医学重点实验室，口腔与颌面重建与再生国家重点实验室
摘要
PCSK9在骨代谢中的作用近年来已成为研究的热点领域。本研究发现，卵巢切除（OVX）小鼠血清中的PCSK9水平显著升高（约1.2倍），OVX小鼠骨髓干细胞中的PCSK9水平也升高约3倍，这与骨密度下降有很强的相关性，表明PCSK9参与了雌激素缺乏引起的骨丢失。基因敲除PCSK9后发现，该蛋白可通过改善骨微结构（使小梁骨体积分数BV/TV增加50%）、促进骨形成（血清PINP增加30%）和抑制骨吸收（血清β-CTX增加10%）来缓解骨质疏松症，从而证实了其双重调节功能。基于这些发现，我们通过将外泌体表面修饰抗硬化素（anti-SCL）片段，构建了一种靶向骨组织的外泌体递送系统。该新型系统能够高效富集外泌体于骨组织（骨组织中的荧光强度增加60%），并成功递送siPCSK9，从而有效沉默骨髓中的PCSK9表达。在OVX骨质疏松小鼠中，这种靶向干预显著减少了骨丢失，其骨量比未经处理的OVX组增加了2倍。我们的工作不仅阐明了PCSK9在骨质疏松发病机制中的关键作用，还为基于外泌体的精准治疗提供了有力证据，具有重要的临床转化潜力。
引言
骨质疏松是一种常见的系统性骨骼疾病，其特征是骨量减少和结构退化，导致骨骼脆弱性增加和骨折风险上升，尤其是在50岁以上的人群中[1]。全球有超过2亿人患有此病，其中髋部骨折的死亡率高达15-30%，致残率为50%，因此这是一个重要的公共卫生问题[2]。骨形成主要由成骨细胞介导，而骨吸收主要由破骨细胞介导，两者之间的不平衡是导致骨丢失的主要原因[3]。在获得性骨质疏松中，长期使用糖皮质激素（导致糖皮质激素诱导的骨质疏松，GIOP）和绝经后雌激素缺乏（导致绝经后骨质疏松，PMOP）是最常见的两种类型，它们的机制有所不同[4],[5]。这两种类型的骨质疏松都表现为骨重塑的严重失衡和快速的骨丢失，同时影响成骨细胞功能并促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向脂肪细胞的转化[6]。目前，骨质疏松的药物治疗主要分为两类：抗吸收药物（如双膦酸盐、地诺单抗和选择性雌激素受体调节剂SERMs），通过减缓骨破坏起作用；以及促骨形成药物（如特立帕肽和罗莫佐单抗），直接刺激新骨形成[7],[8]。充足的维生素D和钙摄入也被推荐作为重要的辅助治疗措施。尽管这些疗法能有效降低骨折发生率，但它们也存在一些缺点，例如长期使用某些抗吸收药物可能引发不良反应（如非典型股骨骨折或颌骨坏死），部分生物制剂需要通过皮下或静脉注射给药，且目前尚无能够完全恢复受损骨微结构的疗法[9]。这些局限性凸显了寻找新靶点和发展替代治疗策略的临床需求。
近期研究揭示了骨质疏松与脂质代谢之间的关联，为理解骨折风险增加和骨密度（BMD）下降的机制带来了突破[10],[11]。血脂异常通过影响细胞分化、炎症激活和氧化应激等途径促进骨质疏松[12]。脂质代谢产物（如氧甾醇和饱和脂肪酸）会促进破骨细胞活性并抑制成骨细胞存活，而脂肪组织会释放促炎细胞因子，进一步加剧破骨细胞生成并抑制成骨细胞功能[13],[14]。临床和流行病学研究也证实了高胆固醇与骨健康受损之间的直接关联。例如，一项纵向研究发现，老年人血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高与髋部骨密度降低独立相关[15]。另一项大规模纵向队列研究显示，总胆固醇和LDL-C水平升高与髋部骨密度降低有关[16]。因此，骨质疏松被归类为一种“代谢性骨病”[17]。
蛋白酶转化酶亚家族中的丝氨酸蛋白酶/凯辛9型（PCSK9）主要在肝脏中合成，通过调节低密度脂蛋白受体（LDLR）的降解在脂质代谢中起核心作用，从而影响血浆胆固醇水平[18],[19]。PCSK9在炎症刺激和雌激素的作用下上调，且与动脉粥样硬化和2型糖尿病（T2DM）等代谢性疾病有关[20]。它还能激活NLRP3炎性小体，增强炎性细胞因子的分泌，进一步加重骨丢失[21]。孟德尔随机化研究表明，PCSK9抑制剂可能有助于45-60岁人群维持骨密度（BMD），使用PCSK9抑制剂可使骨质疏松风险相对降低约14.9%[22]。然而，PCSK9抑制剂治疗与骨质疏松性骨折风险之间的关系可能存在人群差异。值得注意的是，肥胖与骨骼健康之间的关系复杂且具有部位特异性。虽然肥胖通常会导致某些部位（如髋部）的骨密度增加，但这种增加并不一定意味着骨微结构的改善或骨折风险的降低。因此，在研究PCSK9在肥胖相关骨骼变化中的作用时，需要综合考虑其对骨密度、骨质量和整体骨折风险的综合影响。为了探究PCSK9在骨组织中的特异性作用，本研究采用了基于工程化外泌体的siRNA递送系统，实现骨组织内PCSK9表达的靶向下调，从而为进一步机制研究和临床验证提供了基础。
实验部分
实验动物
本研究使用的PCSK9敲除小鼠和野生型C57BL/6J小鼠来自南京大学模式动物研究中心。该敲除品系最初由Shirya Rashid研究团队开发并报道[23]。通过杂交杂合雄性和雌性小鼠，获得了纯合子（PCSK9?/?）、野生型（WT）和杂合子后代，并在基因型鉴定后用于实验。实验所用小鼠年龄为10-12周。
OVX骨质疏松小鼠中PCSK9表达上调
通过ELISA检测发现，骨质疏松小鼠血清中的PCSK9水平显著高于对照组（约增加20%，p<0.001；图1A）。qPCR分析进一步证实，从骨质疏松小鼠分离出的骨髓干细胞（BMSCs）中PCSK9 mRNA表达水平升高（2.7倍，p<0.01，图1B）。Western blotting在蛋白质水平上也验证了PCSK9的上调（4.5倍，p<0.01）。
讨论
骨质疏松是一种常见的致残性疾病，其特征是骨量减少和结构退化，导致骨骼脆弱性增加和骨折风险上升，尤其是在老年人中。尽管破骨细胞和成骨细胞在骨代谢中的作用已被广泛认可[24],[25]，但最近的研究开始探索其他影响骨骼健康的因素，包括涉及脂质代谢的代谢途径[26],[27]。在本研究中，我们重点关注了PCSK9这种蛋白质。
作者贡献声明
吴红玲：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验设计、软件使用、资源管理、项目统筹、方法学制定、实验实施、数据分析、概念构思。黄丽媛：结果验证、数据分析。宋芳芳：项目统筹、方法学制定。周月丽：撰写——审稿与编辑、实验实施。吴彦茹：数据可视化、结果验证。郑吉奇：数据分析。尹正荣：数据可视化。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82170277、82471018、82271010）和湖北省医学青年人才培训计划的支持。作者声明在本文的撰写和发表过程中不存在任何利益冲突。
