《Current Opinion in Food Science》：Bacteriophage-assisted non-thermal processing of foods: Challenges and innovative concepts to inactivate microbial pathogens
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本综述系统探讨了噬菌体（Bacteriophages）与非热加工技术（NTFP）如高压处理（HHP）、脉冲电场（PEF）、超声波（US）和冷大气压等离子体（CAPP）的协同应用，作为一种极具潜力的生物防控策略。文章重点分析了该组合策略在提升食源性病原体（如李斯特菌、沙门氏菌）灭活效率（可达5–8 Δlog）方面的显著协同效应，同时指出了当前研究在噬菌体稳定性、复杂食品基质相互作用及细菌耐药性风险等方面的挑战，为开发安全、创新且可持续的食品加工系统提供了重要见解。
引言
食源性病原体对人类健康和经济构成重大威胁。主要的致病菌属包括耶尔森菌属、李斯特菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、弧菌属、埃希氏菌属和葡萄球菌属，特别是产孢细菌如芽孢杆菌属和梭菌属，它们主要通过产生毒素导致大量疾病。各种非热加工方法已被用于提供食品安全和微生物学评估。高静水压（HHP）、超声波（US）、脉冲电场（PEF）、紫外光（UV）和冷大气压等离子体（CAPP）被称为“非热食品加工技术”（NTFP），能够灭活广泛的食源性病原体。这些技术由不同能源驱动，已证明其能够保持食品质量，并避免传统加热方法的有害影响。这些技术在其发展和应用阶段各不相同，范围从广泛商业化的方法到仍处于早期研究阶段的新兴技术。HHP和UV已经商业化（用于液体和表面）；PEF处于中试规模和早期商业应用阶段；而US和CAPP则主要处于早期研发阶段。
热处理和化学防腐剂在食品保藏中显示出有限的效果，这是由于它们对非特异性酶失活、蛋白质展开和变性、核糖体损伤、膜完整性、耐药细菌的出现以及健康问题的影响。为了解决这些问题，在食品加工和安全中使用生物抗菌化合物作为生物防治剂正在兴起。噬菌体（phages）是特异性感染细菌的自我复制病毒，被认为是化学防腐剂和类抗生素化合物的潜在替代品。烈性、严格裂解（非温和）的噬菌体已被认为是安全、有效和高效的抗菌替代品。与噬菌体不同，非热技术通过破坏其细胞完整性和生命功能，广泛靶向多种微生物的结构和生化成分。由于温度可能导致病毒蛋白变性并改变细菌酶活性，从而降低噬菌体复制和裂解活性，因此噬菌体可与新型NTFP结合使用。噬菌体特异性靶向宿主细菌，从而保护食品中的有益微生物组，如益生菌或乳酸菌。这种生物防治方法已被证明是灭活对人类健康构成风险的耐药产孢、产毒、生物膜相关和抗生素耐药细菌的相关且适用的技术，并且需要更多创新的灭活方法。许多噬菌体可以在广泛的pH值、盐度和温度范围内感染宿主细菌。具有简单结构和高特异性、对人类和动物无毒和/或非过敏的噬菌体，可作为畜牧业的抗生素替代品，用于对抗细菌感染。这将有助于降低食品中抗生素残留的风险并减少抗菌素耐药性。此外，减少对有益微生物的附带损害以及对食品感官品质的最小影响，使得噬菌体在从“农场到餐桌”应用的食品生物保鲜加工中具有优势。本综述旨在通过智能食品控制来追求非热多障碍技术的创新，以应对单一障碍在应对污染物和交叉污染方面的局限性。
噬菌体辅助的非热食品加工
迄今为止，仅有少数研究检验了所提出的包含噬菌体辅助生物防治的非热多障碍技术。一些研究揭示了与单一障碍相比，在灭活目标病原体方面存在显著的协同或叠加效应。只有少数研究在联合NTFP障碍中使用了完整的噬菌体颗粒而非噬菌体衍生酶（即内溶素）。由产细菌素细菌组成，伴有或不伴有噬菌体颗粒，并与HHP结合的生物防治系统已被证明能显著减少细菌数量，并在联合处理中实现协同灭活。如表1总结，将裂解性噬菌体与NTFP结合，在各种食品基质（如牛奶、鸡蛋、鸡胸肉、生菜、模型香肠和培养基）中持续增强了主要食源性病原体的灭活效果。观察到显著的协同或叠加效应，导致细菌数量大幅减少，通常达到完全根除或将细菌数量降至检测限以下，即使单独处理效果不足。此外，HHP和裂解性噬菌体的组合降低了细菌灭活所需的压力水平，从而提高了HHP和非热技术的成本效益价值。最近一篇重要的综述总结了通过联合非热技术增强细菌灭活的数据。HHP和裂解性噬菌体联合处理牛肉上的福氏志贺菌以及鲑鱼和贻贝上的霍乱弧菌，导致了显著的细菌灭活。虽然单独应用噬菌体或高压无效，但HHP和烈性噬菌体（VP）作为有效的障碍干预措施，在肉类和海鲜加工过程中显示出成功的病原体控制。与同时VP/HHP处理或单独的HHP加工相比，顺序HHP/VP障碍策略可在最小化加工方法内提供更高的能源效率和工艺生产率。
目前，关于由包含噬菌体的障碍引起的亚致死损伤的数据缺乏。因此，可以得出结论，噬菌体可以作为非热加工（如HHP和NTFP）之后的二级屏障，这些加工不干扰噬菌体裂解活性。然而，处理顺序需要更详细地研究，因为表1中列出的大多数研究使用了相反的顺序，即先应用NTFP。
Ayk?n‐Din?er等人关于在火鸡胸肉片上使用超声波、噬菌体和乳酸在有氧和真空条件下灭活肠炎沙门氏菌的比较研究显示，细菌减少程度不同，从而提高了食品安全性。然而，这项研究没有使用联合障碍处理，而是使用了单独处理（20 kHz US, 108PFU mL-1噬菌体, 3% 乳酸; 15分钟），初始细菌负载并未完全灭活。
联合新技术，如臭氧水和等离子体活化水（PAW），已被用于对抗食源性病原体，显示出增强的微生物灭活功效。此外，PAW辅助噬菌体联合处理接种在生菜叶上的鼠伤寒沙门氏菌显示出显著的灭活效果。当噬菌体处理在PAW处理之前应用时，该处理的协同效应高于相反的顺序。对噬菌体在各种HHP参数下的稳定性或裂解活性的研究综述证实，结合这两种方法可以成功灭活病原体。噬菌体的裂解活性已在压力、时间、温度、食品基质和噬菌体基因组材料类型的工艺参数下进行研究，结果表明代表性的DNA噬菌体比RNA噬菌体更稳定。
表中的数据支持这样的结论：噬菌体-NTFP组合是储存稳定的抗菌策略，能够改善不同环境、温度和微生物靶点下的食品安全。这些综合方法对于不能加热的微加工食品尤其有前景。它们还降低了整个冷藏储存期间病原体再生的风险。
除了每种灭活机制的优势外，联合噬菌体-NTFP多障碍的顺序（图2）是一个尚未深入研究的领域。图2展示了一个升级的联合方法模型，该模型使用同步或顺序的创新方法，结合工程化噬菌体技术，在一个多障碍食品加工过程中实现更高的食品安全和质量。需要进一步研究以识别知识差距、设计方法论并评估模型和真实食品系统中的输出。一个主要优势是它可以针对本综述中述及的挑战提供相称的应对方案。
因此，重点在于关注最新的研究，以确定建立最佳非热联合创新多障碍的关键因素，强调在不对食品基质产生任何副作用的情况下最大化功效至关重要的特性。
噬菌体相关非热障碍中的挑战
虽然HHP是在噬菌体辅助灭活背景下研究最广泛的技术，但关于PEF、US和CAP的新兴证据表明了可比的机遇和局限性。为了提供平衡的视角，重要的是要强调每种技术通过不同的物理化学机制与噬菌体颗粒和细菌细胞相互作用——电场诱导的膜透化（PEF）、空化驱动的破坏（US）和活性物质生成（CAP）——这可能差异性地影响噬菌体稳定性、吸附效率和宿主细胞敏感性。因此，跨不同NTFP组合存在关键的知识差距，需要建立一个概念框架并为噬菌体辅助NTFP的研究创建模型。
食品-噬菌体相互作用已被提出作为噬菌体在食品加工中应用的一个问题，裂解性噬菌体活性可能受到食品化合物和NTFP处理强度的影响。样品环境（食品/培养基组成）影响噬菌体活性，食品充当噬菌体保护剂。这种担忧指的是噬菌体与食品基质中微生物群落之间的相互作用。食品基质的物理化学性质、离子强度和噬菌体等电点可能通过阻断受体结合蛋白（RBPs）来阻碍噬菌体吸附，并促进压力保护效应，而某些具有抗噬菌体活性的化合物可能会使噬菌体失活。然而，这些说法不能对噬菌体裂解活性构成明显的挑战，这取决于与宿主细菌RBP的特异性相互作用及其作为非热生物防治系统的功效。只有一项已发表的研究调查了噬菌体和CAPP（PAW + 噬菌体）的组合，证明了协同的6-log减少。然而，更广泛的机制理解仍然有限。此外，在评估相对于仅使用噬菌体对照的Δlog改进方面，定量研究被发现是一个关键的知识差距。当前研究报告超声波单独处理的Δlog减少为1–3 logs，但噬菌体-US协同作用在真实食品基质中的量化仍然很差。
现有研究的一个一致局限性是严重依赖模型培养基，这通常会高估处理效果。真实食品基质引入了粘度、颗粒物、脂肪含量和离子强度变化，这些会损害噬菌体扩散并降低NTFP传递效率。定量比较表明，模型系统中的Δlog减少可能比相应食品基质中高1–4 logs，这强调了在评估真实协同相互作用时需要针对特定基质进行评估。
虽然基于噬菌体的处理，像传统的抗菌剂一样，可以显著减少微生物负载——特别是目标病原体——但它们很少能实现完全消除。尽管有讨论认为产品中残留的噬菌体可能会干扰传统的基于培养的病原体检测，因为活性噬菌体可能在富集过程中裂解目标细菌，可能导致细菌计数低估。为了确保准确监测，下游检测方案应考虑噬菌体的存在——通过中和步骤、经过验证的富集方法或补充的分子方法——从而使已证明的抗菌益处与可靠的食品安全评估保持一致。导致细菌不完全灭活的主要因素应被确定。如一些研究报告所述，食品基质内的物理障碍以及由此导致的噬菌体裂解活性限制是导致此结果的主要因素。此外，由于食品加工的局限性而出现的噬菌体耐药细菌菌株被称为食品安全的挑战。虽然一些出版物对此主题持不同意见。有对比研究发现，食品成分或基质并未参与噬菌体失活或影响裂解活性。使用单一噬菌体通常会导致较高的耐药率，而噬菌体鸡尾酒疗法可减轻耐药性的发展并提高灭活效率。此外，一项研究建议在食品加工接近结束时应用噬菌体，以减少噬菌体耐药突变体的出现和病原菌的不完全灭活。研究发现，使用单一噬菌体通常会导致较高的细菌耐药率，而噬菌体鸡尾酒疗法显著减轻了耐药性的发展并提高了灭活效率。
即使病原体减少1或2个对数，也已导致食品安全和公共健康的显著改善。噬菌体生物防治平均减少目标细菌1-3个对数，具体取决于噬菌体分离株、目标物种、接种剂量和食品种类，这提供了强有力的保护，而更严厉的干预措施，如热处理和辐照，声称可达5个对数的减少。使用剂量大于三倍的抗菌接种物，已实现细菌减少高达5-8个对数。灭活耐药细菌，是使用包含噬菌体生物防治的联合非热多障碍最具优势的方面。
先前研究中的大多数这些挑战已通过使用噬菌体衍生的溶菌素得到解决，与完整噬菌体不同，溶菌素不依赖于特异性结合，并作为具有高裂解活性的主动抗菌机器发挥作用。为了最小化耐药性发展的风险，溶菌素通常被用来替代完整的噬菌体，代价是失去了它们靶向细菌的特异性，并扩大了细菌灭活中的宿主范围，从而在非热灭活病原体方面具有高效率。然而，本综述强调这一事实：尽管溶菌素直接作用于细菌细胞壁，绕过吸附障碍，并在与NTFP整合时表现出协同效应且耐药风险较低，但它们缺乏自我扩增能力，可能影响非目标细菌，并且生产成本高于完整噬菌体，而完整噬菌体具有高度特异性、自我复制且成本效益高。此外，研究倾向于使用定制的噬菌体鸡尾酒疗法、经过基因改造的噬菌体，这些噬菌体没有任何脱靶效应，并且相对于抗生素和化学防腐剂具有明显优势，并且比使用溶菌素面临更少的挑战。商业噬菌体产品、工程化噬菌体或固定在纳米颗粒上的噬菌体鸡尾酒疗法已被用于提高食品安全中的噬菌体生物防治。策略包括利用电荷差异固定鸡尾酒疗法、基于乳清蛋白膜的微胶囊化、静电纺丝和电纺纳米纤维，采用基于障碍的方法，可能增强噬菌体在多障碍处理中的效率。
然而，噬菌体在广泛食品基质中的应用增加、克服细菌对噬菌体的耐药性、大规模噬菌体生产、向动物递送噬菌体、基于噬菌体加工产品的监管和市场接受度等问题仍在研究中。此外，需要进一步研究以理解联合灭活障碍的作用机制并澄清相互矛盾的结果。
非热障碍技术中的噬菌体灭活
由于噬菌体基因组通过水平基因转移（HGT）存在的嵌合性以及病原菌的遗传变异，针对产孢和产毒细菌，食品加工处理中噬菌体的灭活挑战已被强调。为了应对这一挑战，使用严格裂解性噬菌体是防止出现更强毒力食源性病原体的最佳选择，而新兴的溶原性噬菌体或应激诱导的原噬菌体则代表了通过HGT传播毒素基因的风险途径。HHP可以在灭活产孢细菌方面发挥作用。用于噬菌体灭活的NTFP尚未得到广泛研究。噬菌体在孢子形成前减少营养细胞，并且对于休眠孢子，在联合NTFP中有效发挥作用。冷等离子体联合噬菌体已被用于灭活食源性病毒和噬菌体。CAPP表明了活性氧（ROS）浓度在噬菌体灭活中的作用、在大气压下的快速杀病毒活性以及非热等离子体射流的作用。
噬菌体在HHP下的裂解活性已在不同食品基质中进行评估。可变的压力大小、食品基质的物理状态和pH值影响噬菌体和食源性病毒的灭活。先前的研究报告称，在测试的特定压力-时间条件下，初始噬菌体负载并未显著影响HHP下的灭活动力学。然而，这一观察似乎是系统特异性的，因为噬菌体对压力的敏感性取决于衣壳形态、基因组类型、食品基质和压力保护成分。具有压力保护作用的食品基质支持噬菌体活性，并且在低pH值下观察到噬菌体灭活增强。碳水化合物和氨基酸、胞外多糖、脂多糖和金属化合物已被发现对食品中噬菌体活性产生物理化学影响。
噬菌体在特定环境条件外不稳定。高温、酸性或碱性环境、盐浓度或紫外光可能显著降低其活性。大多数噬菌体通过短时间暴露于高温而完全失活；尽管有些能够在巴氏杀菌温度下存活或显示出热耐受性。因此，NTFP处理前/后的噬菌体灭活控制对食品安全具有特定价值。
结论与未来展望
结合新型NTFP技术，在保持质量、避免加热对食品感官、物理化学和营养特性不利影响的同时，提供了显著更健康的食品，并改善了食品安全。噬菌体辅助的新型非热技术在高效灭活细菌，特别是产毒、产内孢子、抗生素耐药或生物膜产生细菌方面显示出巨大潜力，以此作为对开发更创新生物防治方法和食品加工的回应。除了预期的益处外，该领域仍然受到关键知识差距的限制，包括对NTFP（尤其是PEF、US和CAP）的定量比较不足、对联合障碍处理下噬菌体稳定性的不完全理解、来自真实食品基质的数据有限，以及缺乏描述每个障碍Δlog贡献的预测模型。此外，对于大多数技术而言，处理顺序——无论是噬菌体→NTFP还是NTFP→噬菌体，或在NTFP障碍内应用噬菌体——仍然定义不清。因此，通过标准化实验框架和机制研究来解决这些差距是基本要求。有价值的研究和联合噬菌体-NTFP的智能设计为食品生物技术和工业提供了一波新的创新浪潮，确保微生物安全、最小化能源消耗、减少排放、提高利润、可负担性、质量以及更多优势，最终改善全球人类和动物健康。联合噬菌体-NTFP障碍可以可靠地放大和/或整合到工业加工中。
