通过两阶段真菌-细菌共培养的强化生物工艺提高木质纤维素的丁醇产量

《Environmental Research》：Enhanced butanol production from lignocellulose via a two-stage fungal-bacterial co-culture consolidated bioprocessing

微生物联合培养体系实现丁醇高效生产，采用曲霉RUT-C30酶解与梭菌NCIMB 8052发酵两阶段策略，通过优化氧平衡和补充底物使丁醇产量达5.05 g/L。

　　

作者：樊一阳、李建政、杨天远、王富饶、连旭、孟佳

中国哈尔滨工业大学环境学院国家安全处置工程研究中心，哈尔滨 150090

摘要

纤维素酶的高成本在木质纤维素生物质的丁醇生物精炼过程中一直是一个难题。本研究开发了一种微生物联合体，将木质纤维素降解菌Trichoderma reesei RUT-C30与丁醇生产菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052结合，直接将碱预处理后的稻草（RS）转化为丁醇。建立了一个两阶段培养模型，包括酶生产阶段和发酵阶段，从4.5%（w/v）的稻草负荷中生产出2.10 g/L的丁醇。通过在发酵阶段添加2%（w/v）的稻草和0.5 g/L的L-半胱氨酸，丁醇产量提高到了5.05 g/L。β-葡萄糖苷酶活性是决定丁醇产量的主要因素，而发酵效率可能得益于较低的氧化还原电位和降低的培养基粘度。本研究为协调具有不同氧气需求的微生物联合体提供了一个战略框架，从而促进了从木质纤维素生物质中更高效地生产生物丁醇。

引言

用可再生能源替代化石燃料是满足巨大资源需求和应对气候变化影响的紧迫全球任务（Bansod等人，2024年；Sikiru等人，2024年）。生物丁醇作为一种燃料和化学平台具有战略价值（Harvey和Meylemans，2011年）。由于其高能量密度和与现有基础设施的良好兼容性，它在使用非食品木质纤维素原料的生物精炼中受到了广泛关注（Serrano-Echeverry等人，2025年）。丁醇形成的核心生物催化剂是Clostridium属菌（例如C. beijerinckii、C. saccharoperbutylacetonicum和C. acetobutylicum），它们可以进行丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵（Chacón等人，2020年；Su等人，2022年；Tekin等人，2023年）。这推动了利用木质纤维素原料进行工业生产的研发。然而，木质纤维素生物质的难降解性是一个主要障碍，因为野生型丁醇生产菌通常无法降解它，需要能耗较高的预处理和外加糖化（Ge等人，2025年；Sikiru等人，2024年）。传统的木质纤维素生物加工过程涉及多个步骤，增加了资本和运营成本，同时增加了污染和产量损失的风险（Xin等人，2019年）。

整合生物加工（CBP）旨在将水解酶生产、酶水解和微生物发酵结合到一个步骤中（Lynd等人，2005年），但这往往超出宿主微生物的新陈代谢能力，从而限制了丁醇的生产效率（Tsoi等人，2018年；Wen等人，2020a）。通过微生物联合体内的代谢分工可以解决这一限制。在这种系统中，水解专家负责底物的分解，为专门生产溶剂的细菌提供可溶性糖，从而减轻了单个菌株的代谢负担（Jiang等人，2020年；Tomita等人，2019年；Wen等人，2020c）。与细菌纤维素酶相比，真菌纤维素酶具有更高的水解效率（Ding等人，2012年），这使得纤维素降解真菌成为木质纤维素丁醇生产的理想伙伴（Galanopoulou和Hatzinikolaou，2016年）。例如，Tri等人报道在厌氧条件下，使用C. saccharoperbutylacetonicum和纤维素分解菌Phlebia sp. MG-60-P2的共培养从碱预处理的竹子中生产出了0.5 g/L的丁醇（Tri等人，2024年）。然而，由于Phlebia在厌氧条件下的强烈乙醇发酵作用，丁醇的选择性受到限制，导致碳流从丁醇生产中转移（Tri和Kamei，2020年）。 Trichoderma reesei是一种典型的纤维素分解真菌，在过去几十年中经历了广泛的研究和开发，使得低成本生产高产纤维素酶复合物成为可能（Bischof等人，2016年）。T. reesei在好氧培养条件下能够产生约20 mg/mL的胞外纤维素酶（Peterson和Nevalainen，2012年）。因此，在CBP中使用T. reesei的一个关键挑战是在好氧阶段平衡纤维素酶的分泌与厌氧阶段所需的 fermentable sugars的供应。T. reesei的固有氧气消耗可以被利用来创造厌氧微环境，支持代谢差异化的联合体，这一策略已被验证可用于生产短链挥发性脂肪酸和乳酸（Shahab等人，2020年；Shahab等人，2018年）。然而，这种策略需要精确的通气控制，而T. reesei的固有代谢活性不足以创造严格的厌氧环境（Shahab等人，2020年）。顺序接种是一种可行的策略，可以在联合体内解决相互冲突的氧气需求（Troiano和Studer，2025年）。这种方法允许真菌和细菌伙伴在各自的最佳条件下发挥作用（Kiyoshi等人，2015年；Wen等人，2020b）。

此外，T. reesei具有一定的厌氧发酵能力，尽管其细胞生长和纤维素酶活性略有降低（Xu等人，2015年）。本研究提出了一种顺序策略：首先使用Trichoderma reesei RUT-C30进行纤维素酶生产的酶阶段（Bischof等人，2016年），然后使用产溶剂Clostridium beijerinckii NCIMB 8052进行厌氧发酵阶段来生产丁醇，以碱预处理的稻草（RS）作为代表性原料。最初通过调整搅拌速率来优化发酵的氧气平衡以建立丁醇生产。随后，调整酶阶段的旋转速度，使糖化速率与C. beijerinckii NCIMB 8052的底物吸收能力相匹配，从而动态耦合糖化和产溶剂阶段。最后，为了进一步提高丁醇产量，在发酵阶段开始时实施了原料补充策略，同时添加2%的原料和L-半胱氨酸。本研究旨在为木质纤维素生物质建立一套可重复使用的工艺指南，提供经过验证的参数和操作界限，以实现联合体CBP的稳定放大。

部分摘录

稻草及其碱预处理

本研究使用的稻草来自哈尔滨附近的农场。稻草被机械粉碎至1–3毫米的粒径，然后在1.0%（w/v）的NaOH溶液中以1:15（w/v）的固液比在50°C下浸泡72小时进行碱预处理，以去除木质素并保留纤维素和半纤维素。之后，用去离子水彻底冲洗稻草，直到滤液的pH值达到约7.0，然后在烤箱中干燥

T. reesei/C. beijerinckii联合体的丁醇生产受氧气平衡模式的影响

在提出的T. reesei/C. beijerinckii联合体CBP中，T. reesei RUT-C30从碱预处理的稻草中产生纤维素酶，为C. beijerinckii NCIMB 8052提供 fermentable sugars，同时作为氧气吸收剂以维持低氧条件。如表1所示，碱预处理有效去除了66.1 ± 0.9%的木质素，同时保留了纤维素和半纤维素，使预处理的稻草成为T. reesei RUT-C30的有效底物。

结论

本研究成功建立了一个T. reesei/C. beijerinckii联合体，通过CBP直接从碱预处理的稻草中生产丁醇，无需添加纤维素酶。开发的兩阶段培养策略适应了真菌和细菌不同的生理需求。在最佳条件下（酶生产阶段转速200 rpm，并补充2%的稻草和0.5 g/L的L-半胱氨酸），实现了最高的丁醇产量5.05 ± 0.14 g/L

< /> 王富饶：数据可视化、数据管理。连旭：软件、数据管理。李建政：验证、监督、资源获取、资金争取。杨天远：数据可视化、软件。樊一阳：撰写——初稿、方法学、调查、数据分析、概念化。孟佳：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金争取

<未引用参考文献>

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? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

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作者衷心感谢国家自然科学基金（项目编号：52270100）、中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFD1601000）、黑龙江省自然科学基金（项目编号：YQ2024E028），以及哈尔滨工业大学国家工程安全处置与污泥资源回收研究中心的科学基金（项目编号：Z2024A017）的支持。