单分子磁镊揭示ssDNA 31和52结节的独特动力学及增强的机械稳定性

《Nucleic Acids Research》：Single-molecule magnetic tweezers reveal distinct dynamics and enhanced mechanical stability of ssDNA 31 and 52 knots

本研究通过单分子磁镊技术，首次系统比较了单链DNA（ssDNA）31和52结节结构的机械稳定性和动态过程。研究人员设计了可形成特定拓扑结节的ssDNA序列，发现结节拓扑能显著增强ssDNA的机械稳定性（从~10 pN提升至>30 pN），并揭示了结节收紧过程中吸收16-30个核苷酸的分子机制。该研究为理解核酸结节在病毒基因组和基因调控中的功能提供了新的物理模型，对核酸纳米技术和基因治疗具有重要指导意义。

　　

在生命科学领域，分子结节作为一种特殊的拓扑结构，广泛存在于生物大分子中。从蛋白质到核酸，这些打结的结构往往具有独特的力学性质和生物学功能。特别是在病毒基因组中，DNA和RNA结节被发现参与重要的生物学过程，如病毒DNA的释放和RNA的稳定性维持。然而，尽管RNA假结（pseudoknot）的研究已较为深入，但对于单链DNA（ssDNA）结节系统的力学特性和动态行为的研究仍存在明显空白。理解这些结节结构如何在机械应力下响应，对于揭示其在病毒生命周期和细胞过程中的功能机制至关重要。

为此，研究人员在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表了题为"单分子磁镊揭示ssDNA 3₁和5₂结节的独特动力学及增强的机械稳定性"的研究论文。该研究通过巧妙设计可形成特定拓扑结节的ssDNA序列，结合单分子磁镊技术，首次系统比较了3₁和5₂两种结节的机械稳定性和动态过程。

研究团队主要采用了多项关键技术方法：首先基于DNA折纸技术和模块化组装策略设计ssDNA结节序列；利用AlphaFold3进行结构预测；通过热熔解实验分析热稳定性；采用T5核酸外切酶消化实验评估结节结构的抗降解能力；最重要的是使用自制磁镊系统进行单分子水平上的力谱测量，包括力斜坡和力跳跃实验，以研究结节结构的力依赖性折叠/去折叠动力学。

研究结果从多个方面揭示了ssDNA结节的独特性质：

在DNA结节构建体制备方面，研究人员设计了特异性ssDNA序列，通过退火过程形成3₁和5₂结节结构。这些结构通过DNA折纸技术构建，两端连接GC-rich的双链DNA手柄，形成"生物素-DNA手柄-ssDNA结节-DNA手柄-巯基"的复合结构，便于磁镊实验中的固定和拉伸。

ssDNA结节熔解分析显示，设计的三种ssDNA结节序列具有相似的熔解温度（T_m约68-71℃），表明热熔解分析无法区分这些ssDNA序列形成的不同结构。然而，天然聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果显示，设计用于5₂结节的ssDNA序列可形成多种构象，其中结节构象表现出更强的抗T5核酸外切酶消化能力。

在磁镊样品制备环节，研究人员使用表面经过氨基硅烷化处理的盖玻片构建流动池，通过链霉亲和素包被的磁性微球与生物素标记的DNA构建体结合，形成可用于拉伸实验的DNA系链。

理论模型和数据分析采用了Bell模型来描述结节结构的力依赖性动力学。通过力依赖性展开速率k_u(f)和折叠速率k_f(f)的定量分析，研究人员能够精确描述结节结构的机械稳定性。

关于ssDNA 3₁结节的机械稳定性和收紧转变，研究发现该结节在力增加过程中表现出简单的单步收紧行为，收紧力约为13 pN。通过Bell模型拟合得到展开距离x_u为9.2±0.4 nm，表明收紧的3₁结节吸收了相当于16-18个核苷酸的ssDNA。

特别有趣的是，设计用于5₂结节的ssDNA序列可形成三种不同类型的结构。研究发现这些序列能够折叠成三种不同的构象：发夹结构、3₁结节和5₂结节。这一发现表明，从非结节的线性ssDNA到完全折叠的5₂ssDNA结节的转变可能涉及多个亚稳态中间体。

对ssDNA发夹结构的研究显示，其机械稳定性最弱，展开力约为11 pN。相比之下，ssDNA 3₁结节表现出中等机械稳定性，而ssDNA 5₂结节则展现出极强的机械稳定性，收紧力高达约35 pN。

研究人员还探讨了具有长环的ssDNA 5₂结节序列的转变信号。通过将环区延长至13个胸腺嘧啶（13T），获得了更为舒展的5₂结节结构。这种修饰后的结构仍能形成三种不同的构象，但其机械稳定性与短环版本有所不同。

研究结论表明，ssDNA结构的动力学和稳定性高度受其拓扑复杂性的影响。结节拓扑能显著增强ssDNA结构的机械稳定性，从约10 pN提高至30 pN以上。机械收紧的3₁结节吸收16-18 nt的ssDNA，而5₂结节吸收25-30 nt，表明被隔离的核苷酸数量随着基本拓扑交叉点数量的增加而增加。

讨论部分指出，观察到的发夹和3₁结节可能在从非结节线性ssDNA到完全形成的ssDNA 5₂结节的退火和折叠过程中充当亚稳态中间体。结节拓扑结构通过限制空间自由度和增加能量壁垒，为ssDNA结构提供了显著的机械稳定性，这与在RNA假结和蛋白质结节中观察到的效应相似。

该研究的重要意义在于提供了理解核酸结节机械特性和稳定性的直接物理模型。ssDNA结节增强的机械稳定性使其成为核酸医学和纳米机器中有前景的结构元件，特别是在需要抵抗核酸外切酶降解的应用中。未来对不同核酸拓扑结构在不同环境条件下性质的研究，有望丰富对DNA和RNA结节及其应用的理解。