超低起始量rG4测序技术揭示RNA G-四链体在基因表达与基因组稳定性中的调控作用

《Nucleic Acids Research》：Ultra-low-input rG4-seq reveals the RNA G-quadruplex regulome in gene expression and genome integrity

本研究针对RNA G-四链体（rG4）在生理环境下全面图谱绘制及动态调控机制研究的技术瓶颈，开发了超低起始量rG4测序技术（ULI-rG4-seq），实现了在100个卵母细胞等微量样本中以~140 bp分辨率精确检测rG4。研究发现rG4在转录起始位点和终止位点等关键调控区域显著富集，并结合DHX36（G4R1/RHAU） helicase的急性/慢性功能缺失实验，揭示了其对rG4水平的双向调控作用。该研究不仅深化了对RNA结构动态调控基因表达、RNA稳定性、翻译、转录延伸、基因组稳定性及选择性剪接的机制理解，而且为RNA结构相关疾病的治疗提供了新思路。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，RNA不仅是遗传信息的传递者，其自身复杂的三维结构更是发挥着关键的调控作用。其中，RNA G-四链体（RNA G-quadruplex, rG4）是一种由鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键自组装形成的特殊二级结构。大量研究表明，rG4在转录调控、RNA加工、翻译控制等多种生物学过程中扮演着重要角色，其功能失调与癌症、神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。然而，该领域长期存在一个令人困惑的矛盾：高通量测序研究提示rG4在活细胞内大多处于未折叠状态，而细胞成像数据却显示存在折叠的rG4并依赖其进行基因调控。这种看似矛盾的现象，凸显了当前研究手段在捕捉生理环境下rG4动态形成与调控方面的局限性，特别是对于卵母细胞等珍贵且稀少的细胞类型，传统方法因需要大量起始样本而难以应用。此外，对于DHX36（也称为G4R1或RHAU）这类关键的rG4解旋酶，其体内的生理功能及调控机制仍不甚清晰。

为了突破这些技术瓶颈，并深入探究rG4的生物学功能，研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了最新研究成果。他们开发了一种名为超低起始量rG4测序（Ultra-low-input rG4 sequencing, ULI-rG4-seq）的新技术，能够从仅约100个卵母细胞中实现全转录组范围内rG4的高分辨率图谱绘制。利用这一技术，并结合基因编辑、快速蛋白质降解（Trim-away）、LACE-seq（Low-input Carrier-assisted RNA Endogenous sequencing）、CUT&Tag、蛋白质组学等多种先进手段，系统揭示了rG4的动态分布规律及其特异性解旋酶DHX36在维持RNA结构稳态、调控基因表达和保障基因组完整性中的核心作用。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1. ULI-rG4-seq：对小鼠卵母细胞进行cPDS（carboxypyridostatin）稳定化和甲醛交联后，使用FLAG标记的BG4抗体（一种rG4特异性抗体）进行免疫共沉淀，构建测序文库，实现了微量样本（~100个细胞）中rG4的全基因组定位。2. 基因工程小鼠模型：通过CRISPR-Cas9技术构建了在内源性Dhx36基因位点敲入EGFP-FLAG-AID-ARF-HA多标签的 knock-in (Dhx36^ki/ki) 小鼠，以及利用Stra8-GFPCre驱动的卵母细胞特异性条件性敲除 (Dhx36^fl/fl;SKO) 小鼠。3. 快速蛋白质降解（Trim-away）：在Dhx36^ki/ki卵母细胞中注射GFP抗体和mCherry-TRIM21 mRNA，实现内源性DHX36-GFP蛋白的快速（3小时内）降解，用于研究DHX36的急性功能缺失效应。4. LACE-seq：应用于Dhx36^ki/ki卵母细胞，以鉴定DHX36蛋白在全转录组范围内的RNA结合靶点。5. CUT&Tag：用于分析对照组和Dhx36^fl/fl;SKO组卵母细胞中RNA聚合酶II（Pol II）及其磷酸化形式（Ser2）以及CDK9、HEXIM1等转录延伸相关因子在基因组上的分布。6. 转录组测序（RNA-seq）和蛋白质组学（MS-based proteomics）：分别用于分析mRNA表达水平和蛋白质表达水平的变化。7. 功能表征实验：包括体外受精评估、卵巢组织切片H&E染色和卵泡计数、新生RNA（EU）掺入实验、蛋白质合成（HPG）检测、R环（S9.6抗体）和DNA损伤（γH2AX, 53BP1等）检测、选择性剪接分析（rmats）等。

Development and validation of ultra-low-input rG4 sequencing (ULI–rG4-seq)

研究人员成功开发了ULI-rG4-seq技术，并证实其具有高重复性和特异性。该技术检测到rG4在转录本的非随机分布，尤其在5'UTR和3'UTR区域显著富集，并且在转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）附近也显示出明显的富集信号，提示rG4可能作为关键的结构开关协调转录和转录后过程。通过cPDS稳定rG4，可以检测到更多动态或稳定性较差的rG4构象。

Cytoplasmic compartmentalization of DHX36 and stress-responsive regulation of rG4 structures

通过构建内源标签敲入小鼠，研究发现DHX36在卵母细胞发育过程中主要定位于细胞质，即使在扰动核质运输的条件下，这种定位依然保持。在热激或氧化应激条件下，DHX36与rG4（通过QUMA-1探针标记）共同重组形成细胞质颗粒，表明DHX36-rG4复合物在应激响应中发生动态的空间重构。

Transcriptome-wide analysis reveals comprehensive regulatory networks of DHX36–rG4 interactions

LACE-seq分析揭示了DHX36的结合位点与ULI-rG4-seq检测到的rG4信号在基因组分布上高度一致，特别是在TSS和TES等调控区域。约有3405个转录本是DHX36结合与rG4结构所共享的，占DHX36结合靶点的79%和rG4包含转录本的62%，表明DHX36与rG4存在广泛的功能关联。

DHX36 knockout reveals paradigm-shifting principles in rG4 maintenance

出乎意料的是，卵母细胞特异性敲除DHX36（Dhx36^fl/fl;SKO）导致全局rG4信号显著降低，而非传统认知中因其解旋酶功能缺失而导致的rG4积累。这一现象在QUMA-1染色和ULI-rG4-seq分析中均得到证实，并且这种降低在TSS和TES区域尤为明显。这表明DHX36除了作为解旋酶外，可能在维持细胞rG4稳态中扮演更复杂的角色。

Rapid deletion of DHX36 by trim-away reveals fundamental principles of rG4 homeostasis

为了区分急性和慢性DHX36缺失的影响，研究人员利用Trim-away技术在Dhx36^ki/ki卵母细胞中快速降解DHX36。与慢性敲除相反，急性DHX36缺失导致了rG4结构的积累。这一发现揭示了一个重要的生物学原理：对同一因子的急性和慢性缺失可能引发相反的细胞反应，DHX36既作为rG4的急性解旋酶，也作为其长期稳态的维持者。

rG4 structural dynamics orchestrate global mRNA stability control

RNA-seq分析表明，在Dhx36^fl/fl;SKO卵母细胞中，含有rG4结构的转录本更容易发生下调。转录抑制实验进一步证实，DHX36的缺失选择性降低了rG4包含转录本的半衰期，而对非rG4转录本影响较小。例如，重要的母源效应基因Zar1和Zar1L的mRNA水平分别下降了70%和40%。这表明DHX36介导的rG4解旋对于维持关键调控因子的mRNA稳定性至关重要。

DHX36 functions as a master regulator of translation through G-quadruplex recognition

代谢标记（HPG）和蛋白质组学分析显示，Dhx36^fl/fl;SKO卵母细胞的蛋白质合成能力显著降低。研究人员构建了一个双荧光报告系统（rG4调控的mCherry和无rG4的EGFP），实时监测显示在DHX36缺失条件下，rG4包含报告基因的翻译受到特异性抑制。对内源基因Ybx2的分析也验证了这一点：其mRNA水平升高，但YBX2蛋白水平却下降，证明了rG4结构对翻译的抑制作用以及DHX36在解除这种抑制中的关键作用。

RNA G-quadruplex dynamics orchestrate transcriptional elongation through DHX36-mediated regulation

新生转录（EU掺入）检测发现Dhx36^fl/fl;SKO卵母细胞转录活性降低，但免疫荧光和CUT&Tag分析却显示RNA聚合酶II（Pol II）总量增加且在启动子近端区域积聚，提示存在转录暂停。进一步分析发现，这种Pol II暂停现象在rG4包含且DHX36结合的转录本中更为显著。机制上，研究发现两个关键的转录延伸正调控因子Ccnt1（Cyclin T1）和Tcea1的转录本含有rG4结构，尽管其mRNA水平变化不一或不显著，但在DHX36缺失或cPDS处理下，CCNT1和TCEA1的蛋白水平均显著降低，同时伴有延伸形式Pol II（Ser2磷酸化）及其激酶CDK9的减少。这表明DHX36通过调控含rG4的延伸因子mRNA的翻译，间接影响了核内的转录延伸进程。

Transcriptional elongation defects trigger R-loop-mediated genome instability in the absence of DHX36

上述转录延伸缺陷导致了R环（DNA:RNA杂交体）的积累和DNA损伤反应（γH2AX, p-CHK1, RAD51, 53BP1信号增强）的激活。重要的是，用cPDS稳定rG4可在对照卵母细胞中重现R环积累和DNA损伤表型。而通过注射RNaseH1 mRNA（降解R环）或使用α-amanitin抑制转录，均可缓解Dhx36^fl/fl;SKO卵母细胞中的DNA损伤。这证实了“DHX36缺失 → rG4稳态破坏 → 延伸因子翻译受损 → 转录延伸障碍 → R环形成 → DNA损伤”的因果链条。

Cytoplasmic RNA G-quadruplex regulation influences nuclear splicing events

RNA-seq选择性剪接分析发现，DHX36缺失导致大量剪接事件发生改变，其中外显子跳跃（SE）事件最为突出。研究发现多个剪接调控因子本身是DHX36的靶标或其转录本含有rG4结构。例如，Srsf9基因含有rG4且被DHX36结合，在Dhx36^fl/fl;SKO卵母细胞中，其mRNA和SRSF9蛋白水平均下降。这揭示了细胞质中DHX36对rG4的调控可以通过影响剪接因子的表达，进而影响核内的RNA加工过程，实现跨区室的基因表达协调。

RNA G-quadruplex homeostasis safeguards female reproductive potential

生理功能上，Dhx36^fl/fl;SKO雌性小鼠完全不育，其卵母细胞数量随年龄增长急剧下降，卵巢内卵泡储备过早耗竭，表现出早发性卵巢功能不全（POI）的表型。超数排卵实验获得的卵母细胞大多停滞在生发泡（GV）期，无法完成减数分裂成熟。

讨论与总结

本研究通过技术创新与系统生物学分析，极大地深化了对RNA G-四链体生物学功能的理解。ULI-rG4-seq技术的建立为在生理相关样本中研究RNA结构动力学提供了强大工具。研究最引人注目的发现之一是揭示了DHX36在调控rG4稳态中的双重角色：急性缺失导致rG4积累，符合其解旋酶功能；而慢性缺失却引起rG4水平全局性下降，提示存在复杂的反馈调节网络以维持细胞内的RNA结构平衡。

更重要的是，本研究阐明了rG4结构作为核心调控元件，通过影响mRNA稳定性、翻译效率、进而协调转录延伸和基因组稳定性，形成了一个从细胞质到细胞核的精密调控轴。DHX36作为该调控轴的关键节点，通过解旋rG4，确保重要调控因子（如转录延伸因子、剪接因子）的有效表达，从而维持正常的基因表达程序和细胞功能。在卵母细胞这一对转录和翻译调控极为敏感的模型中，DHX36-rG4调控网络的破坏最终导致严重的发育缺陷和女性不育。

这项研究不仅解决了领域内关于rG4在体内是否形成及其功能的重要争议，而且将RNA结构生物学与生殖生物学、基因组稳定性等多个领域紧密联系起来，为理解相关人类疾病（如不孕症、癌症）的分子机制提供了新的视角，并提示靶向RNA结构可能成为新的治疗策略。