《Food Microbiology》：Polymorphism exploration of
Schizosaccharomyces japonicus strains based on single nucleotide polymorphism and phenotypic analysis
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日本裂殖酵母（S. japonicus）单倍型多样性及与功能特性的关联分析。本研究基于全基因组SNP分析，设计短扩增片段SNP引物S. japonicus-3，成功将195株菌株分为13个单倍型。其中TA和TCA单倍型仅见于贵州紫秋葡萄自发发酵样本，GC和TTA单倍型分别特异关联高多糖产量及絮凝特性。该SNP分型方法为葡萄酒品质稳定化生产提供新工具。
张占燕|王春晓|吴成|张玉轩|王启明|宋安新|吴元根|邱书毅
中国贵州省贵阳市贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究所，教育部山地地区植物资源保护与种质创新重点实验室，邮编550025
摘要：
由于非Saccharomyces酵母的基因组信息有限，其菌株多态性尚未得到充分研究。本研究以Schizosaccharces japonicus（S. japonicus）为研究对象，探讨其多态性。一方面，基于全基因组SNP变异设计了一种新的单核苷酸多态性（SNP）引物，能够区分不同来源的菌株。引物S. japonicus-3可将195个菌株分为13个单倍型，而仅通过引物S. japonicus-3检测到的TA和TCA单倍型仅出现在来自紫秋葡萄自发发酵的S. japonicus菌株中。另一方面，S. japonicus的高多糖产量和高絮凝性与其特定单倍型相关：GC和TTA仅在高产多糖的菌株中被检测到，而TC和CA则与高絮凝性表型相关。本研究为S. japonicus的菌株区分提供了一种新方法，有助于其在葡萄酒产业中的应用。
引言
近年来，非Saccharomyces酵母在葡萄酒酿造中的作用日益突出，因为它们具有增强香气、风味和葡萄酒稳定性的优势（Borren和Tian，2020；Padilla等人，2016；Jolly等人，2006）。已有27种参与葡萄酒发酵的非Saccharomyces酵母的基因组被报道（Wang等人，2023）。然而，与非Saccharomyces酵母相比，非Saccharomyces酵母的菌株多态性研究仍然相对较少。单核苷酸多态性（SNP）作为一种高分辨率的遗传标记技术，在菌株区分方面具有巨大潜力（Gresham等人，2006）。为了研究Saccharomyces paradoxus（S. paradoxus）的遗传多样性和地理分布，对其全基因组进行了测序。提取的SNP数据可用于详细的群体结构和遗传多样性分析（He等人，2022）。尽管基因组水平的SNP差异提供了全面的信息，但区域特异性的SNP也能区分菌株。例如，研究人员通过PCR产物的测序成功鉴定了Saccharomyces pastorianus（S. pastorianus）的30个SNP位点，这些位点能够区分大多数菌株（Ikushima等人，2012）。然而，针对具有酿酒优势的非Saccharomyces酵母的SNP分析研究较少。
典型的非Saccharomyces酵母Schizosaccharces作为裂殖酵母属的代表，也面临类似的菌株区分挑战。菌株区分主要依赖于基因组信息，但属内物种之间的结构复杂性和发育程度不同阻碍了比较分析。截至2024年10月14日，已有93种Schizosaccharces的基因组信息被发表，主要集中在Schizosaccharces pombe（S. pombe）上。其他Schizosaccharces物种的基因组信息不足，部分原因是其分离数量少于S. pombe>，尤其是新发现的物种和分类学名称发生变化的菌株。Schizosaccharces versatilis（S. versatilis）曾被认为与Schizosaccharces japonicus（S. japonicus）密切相关。S. versatilis菌株最初于1945年从美国葡萄汁中分离出来（Wickerham和Duprat，1945）。1982年的一项研究表明，S. japonicus与S. versatilis之间的种间交配效果不如种内交配（Sipiczki等人，1982）。这一观察结果曾导致S. versatilis被暂时视为S. japonicus的变种。然而，1991年的一项研究推翻了这一观点，认为这两个物种应被视为同一物种（Martini，1991），这一观点在后续研究中得到了广泛认可（Vaughan-Martini和Martini，2011）。最新的研究基于交配试验和全基因组分析，建议将S. versatilis视为一个变种（Brysch-Herzberg等人，2024；Etherington等人，2024）。S. versatilis CBS5679的基因组信息于2021年首次发表，促进了该物种的鉴定。
S. japonicus是第二种受到关注的Schizosaccharces物种，仅次于S. pombe，不仅在细胞生物学研究中如此，在葡萄酒发酵研究中也同样重要。先前的研究报道了中国贵州省不同生境中丰富的S. japonicus资源（Wang等人，2019），这为菌株分析提供了大量分离株。此外，S. japonicus对葡萄酒的香气、口感和颜色稳定性有积极影响（Portaro等人，2022；Wang等人，2022）。一些S. japonicus菌株因其出色的发酵性能和细胞絮凝能力在中国获得了专利（Wang等人，2024）。我们的先前研究还发现S. japonicus具有显著的苹果酸降解潜力，降解率超过90%（Q.L. Chen等人，2025）。考虑到S. japonicus菌株在中国贵州省多个地区的自发发酵中的主导地位，进一步研究这些菌株的多态性将有助于其在区域葡萄酒生产中的应用。
尽管如此，在S. japonicus菌株区分研究中仍存在一些挑战。首先，不完整的基因组信息限制了基于基因组的菌株差异分析。第一个S. japonicus菌株于1931年从日本草莓酒中分离出来（Yukawa和Maki，1931）。然而，S. japonicus yFS275的基因组信息直到2013年才首次发表，其染色体级别的组装和发布直到2023年才完成。此外，涉及S. japonicus及其近缘分类单元S. versatilis的分类学修订进一步复杂化了菌株区分工作。我们的团队通过七对微卫星引物和电泳图谱初步将63个S. japonicus分离株分为43个基因型（Q.L. Chen等人，2025）。与依赖电泳图谱解释的方法相比，SNP分析由于其能够在特定序列中显示碱基差异的技术优势，可以更快、更精确地区分菌株。更精细的菌株区分对于筛选具有明确基因型的优良菌株和确保葡萄酒质量的一致性至关重要。
本研究针对的是贵州地区主要的非Saccharomyces酵母物种S. japonicus，该菌株已在我团队中大量分离和保存（Wang等人，2022；Zhou等人，2022）。研究目标是开发一种有效的SNP-PCR基因分型方法来区分不同的S. japonicus菌株，并研究不同基因型的S. japonicus的多糖形成特性和絮凝特性。基于S. japonicus基因组分析SNP差异和SNP高变异区域，建立了SNP-PCR基因分型方法。
研究部分
本研究使用的酵母
本研究使用了313个S. japonicus分离株（Q.L. Chen等人，2025；Zhou等人，2022；Wang等人，2019），一个筛选自中国的FBKL2.9126S. cerevisiae菌株（Wang等人，2022），以及一个商业S. cerevisiae CECA菌株。这些S. japonicus菌株的来源各不相同：170个菌株来自2017年贵州省紫云县ZiqiuI品种Vitis davidii F?ex葡萄的自发发酵，35个菌株...基因组水平上的SNP差异分析
选择S. japonicus yFS275的基因组序列作为参考，分析了三个本地S. japonicas菌株的SNP差异（表1）。参考菌株S. japonicus yFS275有两个注释版本：一个染色体级别的组装（3条染色体，16,829,384 bp）和一个支架级别的组装（11,733,154 bp）。我们的本地菌株FBKL2.9SZJ-29、FBKL2.9SZJ-37和FBKL2.9975分别被组装成支架级别，大小分别为10,788,567 bp、10,695,937 bp...讨论
S. japonicus在葡萄酒研究（Domizio等人，2018；Q.L. Chen等人，2025；Chen等人，2026）和makgeolli（Choi等人，2023）中受到了更多关注，这些酵母用于完成酒精发酵并增强风味。研究表明，在炎热潮湿气候条件下种植的葡萄在发酵后期，S. japonicus与S. cerevisiae共同起主导作用...
CRediT作者贡献声明
吴元根：验证、正式分析。邱书毅：研究、资金获取。张占燕：撰写初稿、可视化、验证、方法学、研究。王春晓：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取。王启明：软件、方法学。宋安新：验证、方法学。吴成：资源。张玉轩：软件、方法学未引用的参考文献
Chen等人，2025；Wang和Liu，2013。资助
本研究得到了国家自然科学基金（32572542、32160544、31801523）、贵州省科技项目（ZK[2023]key007、ZC[2022]key006、[2024]116、KJZY[2025]093、[2025]034）、贵州省生态特色食品新品质加工与储存重点实验室（ZSYS[2025]023）、贵州大学人才引进研究项目（[2020]50）、贵州省高层次创新人才培训项目（QKHPTRC-GCC[2022]026-1）的支持...利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
我们感谢贵州大学的Wang教授在基因组分析方面的帮助，以及河北大学的Bao Wenjing在染色体水平上的基因组测序和组装方面的协助。
