《Nucleic Acids Research》：Expanding the landscape of BREX diversity: uncovering multi-layered functional frameworks and identification of novel BREX-related defense systems
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本研究系统解析了原核生物中BREX（Bacteriophage Exclusion）系统及其相关BR系统的分子组成、进化关系和功能机制。研究人员通过大规模基因组挖掘和结构生物信息学分析，揭示了BREX系统通过DNA甲基化修饰区分自我与非我，并利用多种核酸酶效应器实现噬菌体防御。研究发现了三种新型BREX相关系统（BR系统），阐明了其通过招募HerA/FtsK转位酶等组件增强防御能力的分子基础，为理解原核生物免疫系统的进化提供了新视角。
在微生物与噬菌体之间永无休止的进化军备竞赛中，原核生物演化出了多种复杂的免疫防御机制。其中，限制修饰（Restriction-Modification, RM）系统作为最著名的防御系统之一，通过甲基化修饰宿主DNA并切割未修饰的外源DNA来实现自我保护。然而，近年来发现的BREX（Bacteriophage Exclusion）系统展现出了更为复杂的防御策略，其独特的六组分核心结构和非典型限制机制引起了学界广泛关注。
BREX系统最初在细菌中被发现，能够有效防御多种噬菌体感染，但其精确的分子机制和进化关系尚未完全阐明。随着基因组数据的爆炸式增长，研究人员在微生物基因组中发现了越来越多与BREX相关的基因簇，这些系统在组成和结构上展现出惊人的多样性，暗示着原核生物免疫系统比我们想象的更为复杂和精巧。
为了深入解析BREX系统及其相关机制的分子基础，研究人员开展了系统性研究。通过对超过12,000个原核生物基因组的全面分析，结合先进的结构生物信息学方法，研究团队不仅重新定义了经典BREX系统的核心组件，还发现了三种全新的BREX相关系统（BR系统），揭示了这些防御系统在进化过程中的模块化重组和功能创新。
研究发现，BREX系统的核心由六个保守组件构成：BrxC ATP酶、BrxX甲基转移酶（MTase）、PglZ、BrxA、BrxB和BrxL。其中，BrxC作为AAA+ATP酶，可能作为支架蛋白介导复合物组装；BrxX负责宿主DNA的甲基化修饰；而PglZ则是主要的效应核酸酶。值得注意的是，研究首次详细解析了这些蛋白的完整结构域架构，发现了多个此前未表征的DNA结合和蛋白质相互作用结构域。
特别值得关注的是，研究发现了BR系统的三种新型变体，它们与经典BREX系统共享核心组件，但具有独特的效应机制。Type-1 BR系统采用经典的PglZ作为主要效应器；Type-2 BR系统则招募了HKD内切DNA酶；而Type-3 BR系统展现出最为复杂的组织形式，整合了BREX核心组件与HerA/FtsK转位酶等功能模块，可能通过DNA捕获机制增强防御能力。
研究人员还发现了一种全新的BREX相关捕获（BRC）系统，该系统将BREX机制与Dnd系统的磷硫酰化（PT）修饰组件相结合，形成了混合防御策略。这种系统可能通过多种分子标记（包括甲基化和磷硫酰化）来区分自我与非我，提供了更为可靠的防御保障。
在技术方法方面，研究主要运用了基因组大数据挖掘、比较基因组学、系统发育分析、蛋白质结构预测和结构比对等方法。通过对NCBI非冗余蛋白质数据库的系统搜索，结合迭代序列分析（PSI-BLAST和JACKHMMER）和基因邻域分析，研究人员全面鉴定了BREX系统及其变体。利用AlphaFold2进行蛋白质结构预测，通过DALI和FoldSeek进行结构相似性搜索，并结合多序列比对和保守性分析，揭示了关键功能域的结构特征和进化关系。
BR系统核心组件的结构特征
研究发现，BREX系统的核心ATP酶组件包含一个典型的AAA+ATP酶结构域，其后是一个翼螺旋-转角-螺旋（wHTH）DNA结合域和一个独特的α+β结构域。C末端则包含一个延伸的卷曲螺旋区域，可能介导蛋白质寡聚化。这种结构组织提示BrxC可能形成六聚体环状结构，围绕DNA组装，其C末端结构域延伸为长的臂状结构，用于识别和相互作用DNA。
PglZ效应器的多功能特性
PglZ作为BREX系统的主要效应器，其结构分析揭示了一个N端的失活Swi2/Snf2解旋酶结构域，其后是多个快速进化的HTH样结构域。核心包含一个核苷酸焦磷酸酶（NPP）折叠，而C末端则是一个β-三明治结构域，与免疫球蛋白样结构域相似。这种复杂的结构组织使PglZ能够发挥多种功能，包括DNA结合、入侵者识别和核酸酶活性。
BrxL解旋酶的域架构
BrxL特异性存在于Type-1和Type-4系统中，包含一个N端的DNA结合域（SIGMA-HTH样结构域和寡核苷酸结合折叠），一个中央MCM家族AAA+ATP酶结构域，以及一个C端的Lon蛋白酶样结构域。在部分变体中，Lon结构域被HKD内切DNA酶替代，增强了系统的限制能力。
新型BREX相关系统的发现
研究首次系统鉴定了三种BREX相关系统（BR系统）。Type-1 BR系统具有最简单的三元组织（ATP酶、MTase和解旋酶）；Type-2 BR系统额外包含PglW、BrxHI解旋酶和BrxD ATP酶；而Type-3 BR系统则保留了所有六个核心组件，但具有独特的域组织。这些系统在不同类群中的分布表明它们可能通过不同的机制实现噬菌体防御。
BRC系统的混合防御机制
新发现的BRC系统将BREX机制与HerA/FtsK转位酶和Dnd系统组件相结合，形成了独特的捕获基础防御策略。该系统可能通过转位酶介导的DNA捕获和多种修饰标记（甲基化和磷硫酰化）来实现高效的自我/非自我识别。
备份效应器的普遍存在
研究发现在大多数BREX和BR系统中都存在多种备份核酸酶效应器，包括PD-(D/E)XK内切酶、HNH内切DNA酶、HEPN内切RNA酶等。这些效应器可能作为防御失败的保障机制，在主要效应器被噬菌体抗防御蛋白抑制时激活，通过更为剧烈的核酸降解或程序性细胞死亡来阻止噬菌体增殖。
研究结论表明，BREX系统及其相关机制代表了一类高度模块化和可演化的原核生物免疫系统。这些系统通过共享核心组件但差异化效应器的策略，实现了对多种噬菌体的有效防御。其模块化特性使得系统组件能够在进化过程中被频繁重组和优化，从而快速适应不断变化的噬菌体威胁。
讨论部分强调，BREX系统的发现扩展了我们对原核生物免疫系统的认识。与经典的RM系统相比，BREX系统采用了更为复杂的多组件机制和分级响应策略。其通过甲基化修饰实现自我识别，通过多种核酸酶效应器实现针对性限制，并通过备份效应器提供防御保障，形成了一套完整而灵活的防御体系。
这项研究的重要意义在于为理解原核生物与噬菌体之间的进化军备竞赛提供了新视角。BREX系统及其变体的广泛存在和多样性表明，微生物免疫系统的复杂程度远超我们以往的认知。对这些系统的深入研究不仅有助于揭示微生物免疫的基本原理，也为开发新型抗菌策略和基因编辑工具提供了理论基础。研究结果发表于《Nucleic Acids Research》，为原核生物免疫学研究领域作出了重要贡献。
