《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Synergistic Neuroprotection in Parkinson’s Disease via Photobiomodulation and Liposomal Rosmarinic Acid Delivery
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本综述创新性地提出了一种结合近红外光生物调节（PBM）与纳米技术递送迷迭香酸（RA）的双模协同疗法，用于治疗帕金森病（PD）。文章系统阐述了该策略如何通过靶向线粒体功能障碍和氧化应激这两个PD核心病理机制，实现协同神经保护。研究表明，负载RA的脂质体（RA@LP）能显著增强药物稳定性、生物利用度及血脑屏障（BBB）穿透能力，而特定波长（如770 nm）的PBM能有效激活细胞色素c氧化酶，提升ATP生成。体外实验证实，联合疗法在提升细胞活力、恢复线粒体膜电位、降低活性氧（ROS）水平及增强超氧化物歧化酶（SOD）活性方面均展现出显著协同效应，为开发PD疾病修饰疗法提供了前沿方向。
引言
帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，其主要特征是中脑黑质多巴胺能神经元的丧失，伴随氧化应激和线粒体功能障碍。当前的治疗方法主要针对症状缓解，无法阻止疾病进展。因此，开发针对PD核心病理机制的新型疾病修饰疗法迫在眉睫。近年来，光生物调节（Photobiomodulation, PBM）作为一种非侵入性疗法，通过近红外（Near-Infrared, NIR）光照射调节线粒体功能，显示出神经保护潜力。同时，迷迭香酸（Rosmarinic Acid, RA）作为一种天然多酚化合物，具有强大的抗氧化和抗炎特性，但其临床应用受限于较差的溶解度和生物利用度。本研究旨在探索一种结合PBM和纳米技术增强RA递送（RA@LP）的双模协同治疗策略，以同时靶向氧化应激和线粒体功能障碍，为PD治疗提供新思路。
结果与讨论
RA@LP的形态学和光谱分析
通过标准薄膜水化法制备了负载迷迭香酸的纳米脂质体（RA@LP）。透射电子显微镜（TEM）图像显示RA@LP呈球形结构，平均直径约为126 ± 10 nm。动态光散射（DLS）分析表明，RA@LP在PBS中的平均粒径介于130-140 nm之间，且包封RA后粒径未发生显著变化。ζ-电位测量显示，负载RA后脂质体的电位从-21.3 mV升至-6.3 mV，表明RA成功整合入脂质双层并引起结构重排。紫外-可见吸收光谱在324 nm处观察到RA的特征吸收峰，证实了RA的成功包封。通过校准曲线计算，RA@LP的包封效率高达93%，负载浓度为46%。稳定性测试表明，RA@LP在去离子水、PBS和胎牛血清（FBS）中均能保持粒径稳定，96小时内未发生显著聚集，显示出良好的血清相容性和胶体稳定性，适于体内应用。
溶血实验
生物相容性评估通过溶血实验进行。肉眼观察和定量分析均显示，LP和RA@LP处理组仅引起可忽略的溶血（<10%），与阴性对照组无显著差异，而阳性对照组则出现完全溶血。结果表明，LP和RA@LP具有良好的血液相容性，适合静脉注射给药。
血脑屏障（BBB）穿透实验
利用Transwell共培养系统建立了体外BBB模型，以评估制剂的脑部递送能力。将LP和RA@LP用异硫氰酸荧光素（FITC）标记后，定量检测脑室侧的荧光强度。结果显示，与对照组相比，LP-FITC和RA@LP-FITC处理组的荧光强度显著增强（***p < 0.001），表明脂质体 formulation 能有效促进制剂穿透血脑屏障。共聚焦显微镜图像直观地证实了FITC信号在脑室的积累，信号主要定位于细胞边界附近，提示可能通过内吞作用实现跨细胞运输和靶细胞分布。
RA包封与抗氧化分析
通过测定328 nm处的吸光度，计算了不同浓度RA@LP的包封效率。当RA浓度为100 μM时，包封效率达到93%，证明脂质体是RA的有效纳米载体。DPPH自由基清除实验用于评估抗氧化活性。结果显示，游离RA和RA@LP均能清除超过90%的ROS，而空白LP无显著活性，表明RA的包封未影响其自由基清除能力。稳定性测试进一步表明，游离RA在PBS中迅速降解，2小时后仅保留20%的抗氧化活性；而RA@LP在3小时后仍能保持62%的活性，证明脂质体包封显著增强了RA的稳定性。
细胞分化与鱼藤酮（ROT）诱导的PD模型
采用分阶段诱导法将SH-SY5Y细胞分化为适合PD研究的神经元表型。第一阶段使用视黄酸促进神经突生长，第二阶段加入脑源性神经营养因子（BDNF）促进神经元成熟和突触形成。分化后的细胞呈现三角形、扁平状形态，并具有细长的神经突。随后，使用线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（ROT）建立PD细胞模型。通过细胞活力测试优化ROT诱导浓度，确定50 μM ROT处理可使细胞活力降至68%，与文献报道一致，因此选此浓度构建PD模型。
治疗下的细胞活力
首先评估了RA和RA@LP对正常SH-SY5Y细胞的生物安全性。浓度高达100 μM时，细胞活力均保持在90%以上，表明良好的生物相容性。在PD模型中，50 μM ROT诱导显著降低细胞活力至68%。经24小时治疗后，各治疗组细胞活力均较PD模型组有显著改善（#p < 0.05）。游离RA在80 μM时达到最大恢复率（10%），而RA@LP在40 μM时即可实现20%的恢复率，疗效是同等浓度游离RA的2.8倍，表明脂质体递送能显著增强RA的治疗效果，并在更低剂量下取得更好结果。因此，选择40 μM RA@LP用于后续研究。
NIR生物安全性研究表明，770、810和940 nm波长照射15分钟对细胞无毒性，存活率与对照组无显著差异，甚至770和940 nm组略有促进增殖现象，可能与NIR光增强线粒体电子传递和ATP产生有关。单独PBM治疗显示，770 nm波长对PD模型细胞的恢复效果最佳（12%），810和940 nm分别为11%和10%。将40 μM RA@LP与不同波长NIR联合治疗发现，RA@LP与770 nm光联合组的协同效果最显著，细胞活力恢复率达到21%，是单一药物治疗的2倍，是单一PBM治疗的1.8倍。Bliss协同评分分析显示，770 nm + RA@LP组合的拮抗作用最小（-0.12），尽管评分提示轻微拮抗，但联合治疗的整体疗效优于任一单药治疗。
ATP水平评估
ATP水平是评估线粒体功能和细胞治疗效果的關鍵指標。通过ATP标准曲线（y = 19295x – 25295）对细胞内ATP进行定量。ROT诱导使ATP水平降至对照组的55%，表明严重的线粒体功能障碍。单药治疗中，RA@LP和770 nm PBM分别将ATP恢复至67%和69%。联合治疗表现出更强的效果，尤其是RA@LP + 770 nm组合，将ATP水平显著提升至84%，较PD模型组增加29%，远超单药治疗效果。Bliss协同分析显示，RA@LP + 770 nm和RA@LP + 940 nm组合的协同评分分别为0.31和0.10，表明PBM与RA@LP在恢复细胞能量代谢方面存在协同作用。
ATP合酶表达分析
Western blot结果揭示了不同治疗对ATP合酶（ATP5C1）蛋白表达的影响。ROT诱导使ATP合酶表达骤降至对照组的18%。单药治疗中，810 nm PBM将表达提升至145%，940 nm提升至54%，而RA@LP和770 nm PBM仅恢复至25%左右。联合治疗中，RA@LP + 810 nm组合使ATP合酶表达达到对照组的168%，RA@LP + 770 nm和RA@LP + 940 nm均恢复至124%。Bliss协同评分显示，三个波长与RA@LP联用均对ATP合酶表达有正向协同效应（770 nm: 6.61; 810 nm: 0.19; 940 nm: 1.63）。ATP合酶表达模式与ATP水平趋势的不一致提示，除了酶表达量，线粒体 redox 稳态等因素对ATP生成也至关重要。
超氧化物歧化酶（SOD）活性分析
SOD活性是评估细胞抗氧化能力的重要指标。通过WST-1法建立SOD标准曲线（y = 39.3x + 42.6），并计算样品SOD活性。ROT诱导使SOD活性降至对照组的21%。40 μM RA@LP单药治疗将SOD水平提升至32%（恢复11%）。770、810、940 nm PBM单药治疗分别将SOD恢复至27%、24%和23%。联合治疗展现了最强的抗氧化效果，其中RA@LP + 770 nm组合将SOD活性显著提升至49%，恢复率达28%。Bliss协同评分均为正值（770 nm: 0.67; 810 nm: 0.21; 940 nm: 0.25），证实PBM与RA@LP在增强抗氧化防御方面存在协同效应。770 nm波长的最优效果可能与其更匹配细胞色素c氧化酶的吸收光谱有关，能更有效地调节线粒体 redox 平衡。
细胞内ROS水平与线粒体功能分析
使用DCFH-DA染料评估细胞内ROS含量。共聚焦显微镜和流式细胞术结果显示，PD组绿色荧光信号最强，表明ROS水平最高。经RA@LP或PBM治疗后，荧光信号减弱，ROS水平下降。联合治疗组（RA@LP + 770 nm）效果最显著，流式分析显示其使处于高氧化应激（荧光信号102–103）的细胞比例大幅减少，正常细胞（信号10–102）比例从PD组的20%升至59%。JC-1染料用于评估线粒体膜电位。健康线粒体中JC-1形成聚合物发出红色荧光，而膜电位下降时则以单体形式发出绿色荧光。PD组绿色荧光显著，红色荧光微弱。治疗后，红色荧光增强，绿色荧光减弱，以RA@LP + 770 nm组最为明显，表明治疗能有效恢复线粒体膜电位。Bliss协同评分显示三个波长与RA@LP联用对改善膜电位均有协同作用。
细胞凋亡分析
通过FITC标记的Annexin V和7-AAD染色评估细胞凋亡。早期凋亡细胞（ Annexin V阳性）显示绿色荧光，晚期凋亡细胞（ Annexin V和7-AAD双阳性）显示红色荧光。共聚焦图像显示PD组绿色和红色荧光信号均很强。治疗后，凋亡信号减弱，尤以RA@LP + 770 nm联合治疗组信号最弱，表明该联合疗法具有抗凋亡作用。
体内NIR照射安全性评估
采用与体外实验相同的参数（770 nm, 80 mW总功率, 30 mW/cm2功率密度, 15分钟照射）对小鼠背部皮肤进行照射。照射后观察未见肉眼可见的皮肤损伤、烧伤或异常组织反应，证明该NIR参数在体内具有良好的耐受性，不会造成明显组织损伤。
实验部分
详细阐述了RA@LP的合成方法、DPPH抗氧化测定、稳定性测试、包封效率计算、细胞培养与分化、溶血实验、BBB模型建立、ROT诱导PD模型、NIR LED治疗参数、细胞活力检测（Alamar blue法）、SOD活性分析（WST-1法）、JC-1线粒体膜电位检测、Western Blot、ATP检测以及Bliss协同评分计算方法等实验流程。动物实验遵循国立阳明交通大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案（编号1141205）。
结论
帕金森病的治疗仍是医学面临的重大挑战。本研究开发了一种结合近红外光生物调节（PBM）和纳米技术递送迷迭香酸（RA@LP）的双模协同治疗策略。该策略通过靶向线粒体功能障碍和氧化应激这两个PD核心病理环节，实现了协同神经保护。研究表明，RA@LP能有效增强RA的稳定性、生物利用度和脑靶向递送，而770 nm PBM能最优地激活线粒体功能。体外实验证实，联合疗法在提升细胞活力、恢复ATP水平、增强SOD活性、降低ROS水平和改善线粒体膜电位方面均展现出显著优势，尤其是RA@LP与770 nm PBM的组合效果最佳。该研究为开发针对PD根本病理机制的疾病修饰疗法提供了新的、有前景的非侵入性多靶点策略。
