《Analytical Chemistry》：IsoPS-DIA: Dual Functionality of Absolute Targeted Quantification and Global Proteome Profiling
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本文介绍了一种创新的同位素对分离数据非依赖采集（IsoPS-DIA）策略，该策略在一次液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）运行中同时实现了多重绝对定量和全局蛋白质组分析。该方法采用双窗口设计：窄窗口分离轻/重同位素标记肽段以减少共分离干扰，宽窗口捕获全蛋白质组信息。研究以肺癌细胞系中EGFR突变（L858R, G719A, Del19）为模型，验证了IsoPS-DIA具有亚飞摩尔灵敏度（LOQ 36–222 amol）、优异线性（R2= 0.998–0.999）和高重现性（中位CV ～ 3%）。该方法首次实现了内源性EGFR和KRAS驱动突变及其野生型对应物的绝对定量，并揭示了基因组变异等位基因频率（VAF）未能捕获的等位基因特异性表达异质性。同时，IsoPS-DIA在六个细胞系中实现了>6,000个蛋白质的覆盖，揭示了EGFR信号级联和可操作变异（如KRAS-G12S）的变异性。与平行反应监测（PRM）、固定扫描窗口DIA（Fix-DIA）和可变扫描窗口DIA（Var-DIA）的比较证实了IsoPS-DIA在不影响蛋白质组覆盖范围的前提下具有更优的准确性和重现性。IsoPS-DIA兼容Orbitrap和四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）平台，并提供了开源窗口设计工具以促进应用。这些结果表明IsoPS-DIA通过精确、可扩展和可重现的定量，具备了连接基因型和蛋白质型的独特能力，为精准肿瘤学等领域提供了一个广泛适用的平台。
引言
基因组改变驱动疾病的起始和进展，许多靶向疗法已被开发用于靶向这些可操作的突变。然而，基于DNA的检测仍然是治疗决策的标准，它无法确定突变蛋白是否表达达到治疗干预所需的水平。由于药物反应取决于突变状态和蛋白质丰度，迫切需要能够直接定量可成药突变蛋白的分析方法。数据非依赖采集（DIA）已成为一种强大的蛋白质组学策略，但与靶向质谱相比，其在绝对蛋白质定量方面仍然有限。稳定同位素标记肽段结合校准曲线是金标准，但在传统DIA下，轻/重肽段的共分离会产生重叠的碎片离子，使谱图去卷积复杂化并降低定量性能。本研究引入了同位素对分离DIA（IsoPS-DIA）策略，具有同时进行绝对靶向蛋白质定量和全局蛋白质组分析的双重功能。
实验部分
材料与试剂包括三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEABC）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、尿素等。EGFR受体内标肽段通过化学合成。细胞培养使用了六种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系。样品制备包括膜蛋白提取和凝胶辅助消化。LC-MS/MS分析在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid或Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪上进行。IsoPS-DIA、Fix-DIA和Var-DIA的MS1窗口设置不同。光谱库构建使用人类参考蛋白质组和自定义突变数据库。DIA原始文件使用Spectronaut处理。绝对蛋白质定量通过轻/重（L/H）峰面积比确定。统计分析包括余弦相似性评分、信号信噪比（SNR）和变异系数（CV）的比较。生物信息学分析包括使用STRING数据库进行通路富集分析。EGFR和KRAS变异等位基因频率（VAF）通过MassARRAY系统测定。
结果与讨论
IsoPS-DIA策略设计
传统DIA中，固定的宽采集窗口（10–20 Th）对绝对蛋白质定量提出了两大挑战。IsoPS-DIA采用双功能采集设计：（i）对于绝对靶向定量，窄的4 Th窗口将靶向肽段的同位素对分离到两个相邻的窗口中，从而实现独立的完整碎片离子系列并减少离子抑制。（ii）对于全局蛋白质组分析，宽的可变窗口（高达60 Th）最大化蛋白质组覆盖范围。该混合设计在单次LC-MS/MS运行中实现了绝对蛋白质定量的增强准确性和全面的蛋白质组分析。为了简化窗口配置，开发了一个基于网络的IsoPS-DIA设计工具。
IsoPS-DIA增强的检测和定量性能
与固定扫描窗口的常规DIA（Fix-DIA）相比，IsoPS-DIA在代表性EGFR Del19肽段的碎片离子检测方面表现出色。Fix-DIA共分离轻/重前体离子，产生共享的y-和b-离子，仅留下少量独特的低丰度y-离子可用于定量。相比之下，IsoPS-DIA分离轻/重肽段，能够检测完整的碎片离子系列，可定量碎片离子增加了5倍。将IsoPS-DIA与PRM、Fix-DIA和Var-DIA在三个浓度水平（0.75, 2.5, 和 7.5 fmol）的合成肽段上进行比较，IsoPS-DIA显示出优异的碎片峰谱，背景干扰减少。在所有靶向肽段中，IsoPS-DIA将中位SNR比Fix-DIA提高了1.4–2.9倍，比Var-DIA提高了1.9–2.5倍。在最低浓度（0.75 fmol）下，所有七种靶向肽段均被IsoPS-DIA检测到且具有更高的SNR。绝对定量性能通过校准曲线评估，所有方法均显示出良好的线性（平均R2> 0.99）。IsoPS-DIA表现出显著优异的重现性，特别是在低浓度下，在2.5 fmol QC水平的CV为2.2%，与PRM（2.9%）相当，并优于其他DIA方法（Var-DIA: 15.3%, Fix-DIA: 30.3%）。总之，IsoPS-DIA实现了类似PRM的灵敏度，同时保持了DIA的广泛蛋白质组覆盖范围。
IsoPS-DIA定量内源性EGFR突变体和下游信号蛋白质组
IsoPS-DIA应用于六种NSCLC细胞系。使用合成的EGFR突变肽段构建了光谱库。所有靶向肽段在各自的细胞系中均被可靠地鉴定。IsoPS-DIA实现了亚飞摩尔灵敏度，LOD范围为36至222 amol，LOQ范围为121至741 amol，重现性高（中位CV = 2.4%）。定量揭示了跨细胞系的 distinct 表达模式。将突变蛋白的绝对浓度比率与其基因组变异等位基因频率（VAF）进行比较，发现蛋白质水平的突变比率系统地低于基因组VAF，并显示出显著的变异性，表明突变体与野生型等位基因的蛋白质表达与DNA VAF并不严格成比例。除了靶标定量，IsoPS-DIA还能够进行全局蛋白质组分析以绘制下游信号蛋白质组。在所有细胞系中定量了6,183种蛋白质，包括EGFR相关信号通路（Ras-Raf-MEK-ERK, PI3K-AKT-mTOR, JNK, Rho-ROCK, SRC-JAK-STAT）的48种组分。不同的表达模式反映了通路激活状态：L858R突变细胞系显示出更强的下游信号。这些发现支持了EGFR突变丰度与富集的下游通路的蛋白质表达之间存在直接关联。
NSCLC细胞系中EGFR基因型依赖性蛋白质组景观的定量全局分析
使用六种PC9细胞系对IsoPS-DIA、Fix-DIA和Var-DIA的全局分析性能进行了基准测试。尽管IsoPS-DIA分配了更多窗口来分离同位素配对的轻/重肽段，但它使用直接DIA搜索提供了可比较的鉴定结果。IsoPS-DIA的三重复分析实现了优异的定量重现性，78%的蛋白质组显示CV < 10%。将IsoPS-DIA应用于六种NSCLC细胞系，通过直接DIA搜索，每次单针运行检测到5357–5735种蛋白质。差异表达蛋白（DEP）经过标准化、插补和统计过滤后确定。层次聚类显示，PC9和CL68（均带有Del19缺失）聚集在一起，与A549（KRAS-G12S突变）相比，表现出相似的蛋白质组谱，而H3255（L858R）和CL97（G719A）形成另一个簇。H1975具有最低的EGFR表达和突变体/野生型蛋白质表达比率，显示出独特的蛋白质组特征。这些聚类模式与通路水平比较一致。跨六个细胞系共鉴定出3166个DEP。Reactome通路富集分析揭示了每个细胞系中上调蛋白的前十个富集通路。为了证明IsoPS-DIA在不同仪器平台上的普遍适用性，使用Q-TOF仪器（TripleTOF 5600）对相同的三种细胞系应用了该方法。七种EGFR肽段的校准曲线显示出优异的线性，R2值超过0.993。在L858R携带的H3255细胞中定量到了L858R突变肽段及其对应的野生型肽段。总体表达水平与在Orbitrap平台上测量的一致。此外，DIA分析能够在A549、H3255和PC9细胞中分别鉴定出1872、1316和2330种蛋白质。
结论
本研究开发的IsoPS-DIA在单次LC-MS/MS运行中提供双重功能：（i）具有区分突变能力的多重绝对定量；（ii）同时进行全局蛋白质组分析以读取下游信号和耐药通路。方法学上，关键进展是双窗口方案：窄的4 Th窗口将轻/重对分离到相邻的扫描中，消除了混淆同位素稀释DIA的共分离和重叠碎片谱图，而宽的可变窗口保留了蛋白质组覆盖范围。该设计产生更丰富的独特碎片和更高的信噪比（S/N），实现了亚飞摩尔灵敏度（LODs 36–222 amol）、低LOQs（121–741 amol）、高线性（R2≈ 0.998–0.999）和低CVs（～2–3%），接近PRM般的精度，同时不牺牲DIA级别的广度（>5000种蛋白质，取决于仪器）。与SRM/PRM相比，IsoPS-DIA保留了高多重性和系统范围读数。相对于Hybrid-DIA和混合DIA-PRM模式，该方法不依赖于仪器特定的API或靶向事件的占空比权衡，并直接支持绝对（不仅仅是相对）定量。IsoPS-DIA的同位素分离消除了轻/重肽段谱图去卷积的模糊性，并增加了可定量离子的数量和强度。因此，IsoPS在低丰度下表现出改进的准确性——这对于内源性变异肽段至关重要，并结合多蛋白酶策略以最大化突变位点的可检测性，从而区分突变体与野生型形式。实际上，IsoPS-DIA适用于不同平台（Orbitrap/Q-TOF）并使用标准软件。为了促进应用，我们开发了一个开源的、基于网络的IsoPS-DIA窗口设计工具。通过发布此资源，我们旨在促进IsoPS-DIA的广泛采用及其在突变蛋白以及其他靶向或发现蛋白质组学研究中的应用。将IsoPS应用于NSCLC细胞系首次实现了内源性EGFR突变体和野生型蛋白的直接定量，揭示了异质性表达模式和突变体/野生型比率，这些无法从基因检测数据中推断。这些发现凸显了蛋白质水平测量在揭示等位基因特异性表达和转录后调控方面的价值，这对于预测对EGFR靶向疗法的治疗反应至关重要。这种IsoPS策略建立了一种可重现且可扩展的分析方法，作为临床和转化研究中传统基因检测的强大补充。虽然IsoPS-DIA对测试的16种肽段表现稳健，但局限性包括每次运行窄窗口数量有限。高速质谱仪的进步将有助于扩展到更大的靶标面板或进行战略调整以保持分析质量。鉴于其窄窗口设计，IsoPS-DIA最适合用于25-35种靶向肽段（轻-重对）的面板。未来的工作将集中于将该平台扩展到更广泛的靶标组和临床样本类型，从而实现致癌突变及其功能性蛋白质组后果的全面定量读数。
