《Environment & Health》：Exploring Toxicological Mechanisms of Typical PFAS-Induced NAFLD through Integrated Computational Toxicology and AOP Frameworks
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本综述通过整合网络毒理学、机器学习和分子对接等多方法学框架，系统探讨了全氟和多氟烷基物质（PFAS）诱导非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的潜在毒性机制。研究首次确定THBS1下调是PFAS诱导NAFLD的分子起始事件（MIE），并阐明其通过激活PI3K/AKT信号通路引发脂质代谢紊乱和炎症反应，最终导致肝脂肪变性的完整不良结局路径（AOP）。值得注意的是，新型替代物HFPO-TA比传统PFOA表现出更强的促脂质积累能力，为PFAS的代谢毒性风险评估提供了重要理论依据。
1. 引言
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一种由全身代谢紊乱驱动的慢性肝脏疾病，疾病阶段从单纯性脂肪变性（SS）进展至非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可能发展为肝硬化和肝细胞癌。除生活方式因素外，环境内分泌干扰物（EDCs）已成为导致代谢紊乱的关键外源性因素。全氟和多氟烷基物质（PFAS）作为典型内分泌干扰物，与NAFLD的发生发展密切相关。截至2023年，PubChem中注册的PFAS相关化合物超过700万种，其高度稳定的化学结构导致其在全球环境中广泛分布，人类可通过吸入、摄入和皮肤接触等途径暴露。流行病学证据表明，血清PFAS浓度与肝酶水平升高、肝脂肪变性和肝纤维化患病率增加显著相关。
2. 材料与方法
研究从NCBI GEO数据库获取三个数据集（GSE89632、GSE48452和GSE63067），包含45个健康样本、36个SS样本和46个NASH样本。通过SVA R包的ComBat函数消除批次效应，利用limma R包识别差异表达基因（DEGs）。L02细胞在无血清培养基中暴露于1、5和100 nmol/L浓度的PFOA、HFPO-DA和HFPO-TA 24小时。通过转录组检测、蛋白互作（PPI）分析、四种机器学习算法（LASSO、SVM、随机森林和XGBoost）以及分子对接等技术筛选关键基因。采用qRT-PCR、Western blotting、油红O染色和CIBERSORT免疫细胞浸润分析等进行实验验证。
3. 结果与讨论
转录组分析显示，PFOA、HFPO-DA和HFPO-TA暴露组分别鉴定出1178、1040和1136个DEGs。基因集富集分析（GSEA）表明，所有PFAS组中固醇代谢过程和固醇生物合成过程均显著上调。通过机器学习算法交叉验证，发现MYC和THBS1是NAFLD发病机制中的关键基因。分子对接结果显示，THBS1与三种PFAS均具有良好结合亲和力（PFOA：-9.4 kcal/mol，HFPO-TA：-9.7 kcal/mol，HFPO-DA：-7.9 kcal/mol）。体外实验证实PFAS暴露后THBS1表达显著下调，临床转录组数据也显示NAFLD患者肝组织中THBS1表达降低。
研究确定THBS1下调是PFAS诱导NAFLD的分子起始事件（MIE）。THBS1通过负调控PI3K/AKT信号通路维持肝脏脂质稳态，其下调导致PI3K/AKT/mTOR通路过度激活，进而影响脂质代谢关键基因的表达。转录组分析显示，PFAS暴露后PIK3CD、AKT3、mTOR等基因显著上调，而脂质合成相关基因SREBF1、SCD、FASN以及脂肪酸转运蛋白CD36也明显上调。同时，线粒体脂肪酸氧化关键酶CPT1A和CPT2表达下调，表明脂肪酸β-氧化受损。此外，炎症因子TNF-α、IL-6和IL1A表达增加，促进炎症反应。
油红O染色结果显示，所有PFAS在5和100 nmol/L浓度下均能显著增加L02细胞脂滴形成。特别值得注意的是，在1 nmol/L暴露浓度下，HFPO-TA即表现出比PFOA更强的促脂质积累能力，提示新型PFAS替代物可能具有更高的代谢毒性。免疫细胞浸润分析发现，NAFLD患者样本中静息肥大细胞、M2巨噬细胞和活化肥大细胞表达水平与正常样本存在显著差异。
4. 结论
本研究通过整合计算毒理学和实验验证，构建了PFAS诱导NAFLD的AOP框架。该框架以THBS1下调为MIE，通过激活PI3K/AKT信号通路，引发脂质代谢紊乱和炎症反应，最终导致肝脂肪变性。定量证据权重（QWoE）评估得分为78.8，表明该AOP框架具有高度可信性。研究发现新型替代物HFPO-TA比传统PFOA具有更强的肝毒性，这对PFAS类化合物的风险评估和监管策略制定具有重要意义。
