《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Development of a New Method for the Absolute Quantification of Selenoproteins in Chicken Serum by Heteroatom-Tagged Proteomics
编辑推荐：
本文开发了一种结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)与同位素稀释分析(IDA)的新方法，实现了鸡血清中硒蛋白的绝对定量。通过优化色谱分离条件，成功解析了硒蛋白P(SELENOP)与未知硒蛋白的共洗脱问题，并利用UHPLC-ESI-QTOF-MS鉴定该未知蛋白为硒蛋白W(SELENOW)。研究首次揭示鸡血清硒分布以SELENOP为主(57%)，其次为SELENOW(33%)，为家禽硒营养调控提供了重要技术支撑。
引言背景
硒(Se)作为家禽营养中的必需微量元素，通过硒蛋白发挥重要生理功能。硒半胱氨酸(SeCys, U)在硒蛋白中由UGA终止密码子编码，鸡体内已鉴定出26个含SeCys的蛋白基因。目前研究多集中于硒基因表达和Western blot分析，但缺乏血清硒蛋白组的定量数据。传统方法如ELISA存在抗体特异性不足、无法区分异构体等局限，亟需开发高灵敏度的绝对定量方法。
材料与方法
研究采用HPLC-1260系统耦合三重四极杆ICP-MS(ICP-QQQ-MS)，通过柱切换技术连接尺寸排阻柱(SEC)和肝素-琼脂糖(HEP-HP)、蓝-琼脂糖(BLU-HP)亲和柱。以74Se为同位素稀释内标，在氧气(40%)和氢气(2 mL/min)反应气体条件下监测硒同位素。样本为10只罗斯308肉鸡血清（饲喂0.3 mg/kg亚硒酸钠饲料），经离心后直接进样100 μL。
方法优化与验证
初始方法中SELENOP与未知蛋白在20分钟共洗脱（图1a）。通过调整流动相梯度（A：0.05 M乙酸铵，pH=7.4；B：1.5 M乙酸铵，pH=7.4）和流速至1.3 mL/min，实现SELENOP（20 min）与未知蛋白（25 min）的基线分离（图1b）。SeAlb洗脱时间延至31分钟。方法通过BCR-637标准物质验证，检测限与定量限见附表S2-S3。
未知蛋白鉴定
收集25分钟洗脱峰进行胰蛋白酶消化，经ZipTips C18脱盐后，用UHPLC-QTOF分析肽段。通过Agilent MassHunter Bioconfirm软件比对Gallus gallus数据库，SELENOW序列匹配度达88.24%（图3），显著高于其他部分匹配蛋白（SELENOM、SELENOO等）。图2展示消化肽段的原始与去卷积色谱图，图S1为SELENOW序列覆盖图谱。
定量结果分析
13份血清样本数据显示（表1），SELENOP硒含量最高（59.2±13.4 ng Se/mL），其次为SELENOW及其他组分（34.2±5.6 ng Se/mL），Se-代谢物(SMT)、GPx和SeAlb分别占4%、2%和2%。按硒原子数换算蛋白浓度，SELENOP为2.88 mg/L（含13个SeCys），GPx为1.23 mg/L（含1个SeCys）。由于SeAlb中硒以Se-Met形式非特异性结合，无法计算准确蛋白浓度。
讨论与意义
本研究首次实现鸡血清硒蛋白绝对定量，证实SELENOW的存在。该蛋白（85个氨基酸）可能具抗氧化、应激响应功能，但其血清分布机制尚不明确。方法优势在于ICP-MS的高灵敏度（较Western blot可绝对定量）和抗基质干扰能力（IDA校正）。局限性在于饲喂硒源仅为亚硒酸钠，若使用硒代蛋氨酸(Se-Met)可能显著提升SeAlb占比。该技术为家禽硒营养评估及补充策略优化提供了可靠工具。
