靶向Mcl1的人工细胞外囊泡递送CRISPR/Cas9核糖核蛋白用于宫颈癌治疗的新策略

《Cancer Gene Therapy》：Effective delivery of genome editor to cervical cancer targeting Mcl1 for cancer therapy

本研究针对CRISPR/Cas9系统在体内递送效率低和脱靶风险高等挑战，开发了一种基于Lamp2b-PhoCl蛋白分选系统的人工细胞外囊泡(EVs)递送平台。研究人员成功将Cas9-sgMcl1核糖核蛋白(RNP)封装入人工EVs中，证实其可有效抑制宫颈癌细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡。动物实验表明，EVsRNP(Cas9-Mcl1)能显著抑制宫颈癌移植瘤生长，为基因编辑工具的靶向递送提供了新思路。

　　

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为精准医疗领域的革命性突破，为遗传性疾病和癌症治疗带来了前所未有的希望。然而，如何将这一强大的分子剪刀安全高效地递送到靶细胞内部，始终是制约其临床应用的瓶颈问题。传统的病毒载体虽然转染效率较高，但存在插入突变和免疫原性等风险；而非病毒递送系统又往往面临递送效率不足的挑战。特别是在宫颈癌治疗领域，开发一种能够精准递送基因编辑工具且兼具安全性的递送平台显得尤为迫切。

在这项发表于《Cancer Gene Therapy》的研究中，研究人员将目光投向了天然存在的细胞间通讯载体——细胞外囊泡。这些由细胞分泌的纳米级脂质双层结构，天生具有优异的生物相容性和低免疫原性。研究团队创新性地构建了一种人工细胞外囊泡递送系统，通过基因工程手段将靶向抗凋亡蛋白Mcl1的CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物封装其中，为实现宫颈癌的精准基因治疗提供了新策略。

研究的关键创新点在于设计了独特的蛋白分选系统。该团队构建了含有Lamp2b跨膜结构域、光裂解蛋白PhoCl和Cas9蛋白的融合表达载体，利用细胞自身的外泌体生物合成途径，将Cas9核糖核蛋白定向装载到细胞外囊泡中。当这些工程化囊泡被宫颈癌细胞摄取后，在特定光照条件下，PhoCl蛋白发生裂解，从而释放出具有生物活性的Cas9-sgMcl1复合物，实现对Mcl1基因的特异性编辑。

主要技术方法包括：质粒构建与细胞转染技术、超速离心分离细胞外囊泡、透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析用于囊泡表征、Western blot检测蛋白表达、流式细胞术分析细胞凋亡和GFP阳性率、Transwell实验评估细胞迁移、异种移植瘤模型评估体内疗效、免疫组化分析Mcl1蛋白表达、Sanger测序验证基因编辑效率。研究使用了TCGA数据库和临床样本进行生物信息学分析，所有患者样本均获得伦理委员会批准。

Mcl1在宫颈癌中的表达水平

通过分析TCGA数据集和临床样本发现，Mcl1在宫颈癌组织中的mRNA和蛋白表达水平显著高于非癌组织。生存分析显示Mcl1高表达患者预后较差，表明Mcl1是宫颈癌治疗的潜在靶点。免疫组化和qPCR结果进一步验证了这一发现。

生物工程化人工EVs的装载策略及表征

研究人员成功构建了"Lamp2b-PhoCl-Cas9"质粒，通过细胞转染和超速离心获得了装载Cas9-sgMcl1 RNP的人工EVs。透射电镜显示典型的杯状结构，纳米颗粒跟踪分析表明粒径范围为30-1000nm。Western blot证实EVs表达CD63、Alix、Tsg101等经典标志物，同时检测到Lamp2b和Cas9蛋白的成功装载。

人工EVs被受体细胞摄取的过程

PKH26标记实验显示EVs可被HeLa细胞有效内化。表达GFP的EVs^GFP处理组在细胞内检测到明显的绿色荧光，而PBS和空白EVs对照组无荧光信号。EVs^nanoLuc实验进一步证实了EVs递送功能的剂量依赖性。

人工EVs^RNP(Cas9-sgMcl1)在体外抑制宫颈癌细胞增殖和迁移

功能实验表明，与对照组相比，EVs^RNP(Cas9-sgMcl1)处理显著抑制HeLa细胞迁移能力和活力。Sanger测序检测到Mcl1基因位点出现特异性插入缺失突变，Western blot显示Mcl1蛋白表达下降。流式细胞术检测发现实验组细胞凋亡率显著增加。

EVs^RNP(Cas9-sgMcl1)在体内抑制宫颈癌异种移植瘤模型

在荷瘤裸鼠模型中，尾静脉注射EVs^RNP(Cas9-sgMcl1)显著抑制肿瘤生长，而体重无显著变化。免疫组化显示肿瘤组织Mcl1蛋白表达降低，基因测序证实体内编辑效率。

EVs的靶向策略

通过生物素-链霉亲和素系统构建靶向Her2的EVs^GFP，证实可特异性增加Her2阳性细胞的摄取率，而未修饰EVs无此效果，表明表面修饰可增强EVs的靶向性。

EVs^RNP的体内分布和安全性

体内分布实验显示EVs主要在肝脏和肿瘤中富集。值得注意的是，虽然在肝细胞中检测到GFP信号，但仅在肿瘤细胞中检测到基因编辑事件，推测与肿瘤细胞增殖活跃、更易发生CRISPR/Cas9介导的基因编辑有关。

该研究成功构建了一种基于人工细胞外囊泡的CRISPR/Cas9递送平台，实现了对宫颈癌关键靶点Mcl1的高效基因编辑。研究不仅证实了该递送系统在体外和体内的抗肿瘤效果，还揭示了其相对于传统递送方法的独特优势：一方面利用EVs的天然生物相容性降低免疫原性，另一方面通过内源性装载策略提高递送效率。特别值得关注的是，研究发现该递送系统在体内表现出一定的肿瘤选择性，虽然在正常组织中有分布，但基因编辑主要发生在增殖活跃的肿瘤细胞中，这为降低脱靶效应提供了重要保障。

研究的局限性在于尚未系统评估不同 cargo（如化疗药物、mRNA等）的共递送效果，以及表面修饰策略对靶向性的优化空间。此外，脱靶效应的全面评估仍需借助GUIDE-seq等高通量测序技术进一步验证。尽管如此，这项工作为基因编辑工具的临床转化提供了创新性解决方案，不仅为宫颈癌治疗开辟了新途径，也为其他遗传性疾病和癌症的基因治疗奠定了技术基础。随着递送效率的不断提升和安全性评价体系的完善，人工细胞外囊泡有望成为下一代基因治疗递送系统的重要候选。