《Cell Research》：The axon initial segment-associated microglia regulate neuronal activity and visual perception
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本研究揭示了大脑新皮层中一类特异性与兴奋性神经元轴突起始段（AIS）相互作用的小胶质细胞（AISa-MGs），其短暂去极化可通过外向钾离子通道THIK-1释放K+，直接增强相关神经元的动作电位发放，并发现视觉刺激可通过毒蕈碱受体（MR）激活钠通道NALCN诱发此类小胶质细胞过程特异性去极化，进而调控神经集群协同活动及小鼠视觉辨别行为，为理解神经-免疫互作在高级脑功能中的作用提供了新视角。
引言
大脑由多种形态和功能各异的细胞组成，神经元形成密集连接网络进行信号传递与处理，而胶质细胞协同支持并调节神经元功能。作为中枢神经系统（CNS）的先天免疫细胞，小胶质细胞（Microglia, MGs）在生理或病理条件下动态监测脑环境，精细调控神经发生、突触形成、神经环路构建及神经元活动。研究表明，小胶质细胞可直接与大脑新皮层兴奋性锥体神经元（Pyramidal Neurons, PNs）在轴突终末、树突棘、胞体及郎飞结等部位相互作用，实现对其功能的精准调控。近年来，神经元轴突起始段（Axon Initial Segment, AIS）被识别为小胶质细胞-锥体神经元直接相互作用的新位点。AIS是位于轴突近端、富含电压门控离子通道的20–60微米长区段，是神经元动作电位（Action Potential, AP）触发的关键调控部位。AIS的长度、位置、离子通道密度乃至胞外离子浓度均可被严格调控，并显著影响动作电位发放。然而，小胶质细胞是否通过与AIS的直接相互作用调控神经元活动，并进而影响高级感知或认知脑功能，尚待阐明。
结果
新皮层中与神经元AIS相互作用的特殊稳态小胶质细胞亚群
研究首先通过免疫染色可视化新皮层中小胶质细胞与AIS的物理接触。发现约21.03%的小胶质细胞与神经元AIS存在相互作用，其中多数（74.42%）以单一初级或分支过程包裹约69.39%的AIS长度。电镜三维重建显示，AIS与小胶质细胞过程的胞质膜几乎平行，被狭窄的胞外间隙分隔，并存在可能的离散连接结构，表明二者间形成紧密稳定的相互作用。根据小胶质细胞与神经元是否存在胞体-胞体和/或AIS-小胶质细胞过程接触，将其分为四组：Ctrl（无接触）、Soma-only（仅胞体接触）、Soma&AIS（胞体及AIS均接触）和AIS-only（仅AIS接触）。形态学分析显示，与Ctrl组相比，Soma-only、Soma&AIS和AIS-only组小胶质细胞的交叉点数、分支数均减少，且分支长度各异。转录组学（Patch-seq）分析表明，这些相互作用组别共享部分上调和下调基因，其中AIS-only和Soma&AIS小胶质细胞共同上调的基因显著富集于细胞-细胞粘附和信号传导相关通路。蛋白水平验证显示，细胞粘附分子整合素β1（ITGB1）在AISa-MGs（包括Soma&AIS和AIS-only组）的过程上表达更高，提示其可能介导小胶质细胞过程与神经元AIS的物理相互作用。
AISa-MGs短暂去极化特异性促进相关锥体神经元的动作电位发放
通过离体脑片双全细胞记录技术，同时记录与AIS存在物理相互作用的小胶质细胞和锥体神经元。向AISa-MGs注入短暂去极化电流（500毫秒，10 pA）诱导其发生约19.15 mV的去极化，同时向锥体神经元注入电流阶梯（0–150 pA）诱发动作电位。结果显示，AISa-MGs的去极化显著增加了相关锥体神经元的动作电位发放频率，并降低了其激发阈值（Rheobase），但动作电位电压阈值不变。此效应不伴随自发兴奋性/抑制性突触后电流（sEPSCs/sIPSCs）的频率或振幅改变，表明并非通过改变突触传递实现。作为对照，向无物理相互作用的AISn-MGs或仅胞体接触的Soma-only MGs注入去极化电流，则不影响锥体神经元的动作电位发放。利用光遗传学（ChETA-tdTomato）技术短暂去极化AISa-MGs，同样可特异性促进相关锥体神经元的动作电位发放，效应量与电流注射相当。这些结果强有力地表明，小胶质细胞去极化通过其与神经元AIS的特异性相互作用，而非通过胞体、突触或间接途径，来促进神经元兴奋性。
通过THIK-1释放细胞内K+是AISa-MG短暂去极化促进神经元活动的关键机制
研究聚焦于小胶质细胞外向整流钾通道THIK-1，该通道是维持小胶质细胞静息膜电位（Membrane Potential, MP）的主要介导者。免疫染色证实THIK-1蛋白在小胶质细胞特异性表达，且在AISa-MGs的过程上分布更丰富。使用K+选择性微电极检测发现，光遗传学或电流注射诱导小胶质细胞去极化时，其过程附近K+浓度升高约1.8 mM，此效应可被THIK-1抑制剂TPA、特异性拮抗剂C101248或THIK-1条件性敲除（cKO）所阻断。在双全细胞记录中，使用无K+内液记录AISa-MGs以耗尽其细胞内K+后，其去极化对锥体神经元动作电位发放的促进作用消失。直接向锥体神经元AIS局部喷射5 mM K+可诱导亚阈值去极化并显著增加动作电位发放频率。利用膜电位探针ASAP3进行在体双光子成像，发现光遗传学刺激AISa-MGs可在相关锥体神经元的胞体-AIS界面诱发局限于该区域的去极化，此效应依赖于THIK-1。进一步，在记录AISa-MGs时加入THIK-1拮抗剂C101248或使用THIK-1 cKO小鼠，均消除了AISa-MG去极化对锥体神经元动作电位发放的促进作用。相比之下，阻断小胶质细胞另一外向钾通道Kv1.3则无此效应。这些结果证实，AISa-MG去极化通过THIK-1通道释放K+至AIS局部，从而调控神经元兴奋性。
漂移光栅视觉刺激诱发小胶质细胞瞬时去极化事件
在体双光子膜电位成像（利用TMEM119-Cre;ASAP3小鼠）发现，视觉刺激（漂移光栅）可在清醒小鼠V1区小胶质细胞的过程（而非胞体）上诱发幅度约17.33 mV的瞬时去极化事件。THIK-1 cKO后，视觉刺激仍能诱发去极化，但膜电位无法正常恢复至静息水平，表明THIK-1介导的K+释放对于去极化后膜电位恢复至关重要。机制探讨显示，视觉刺激诱发的去极化事件可被毒蕈碱受体拮抗剂东莨菪碱（Scopolamine）阻断，而非P2Y12受体或肾上腺素能受体拮抗剂。同时，AISa-MGs中编码钠通道NALCN的基因Nalcn表达上调，蛋白水平证实NALCN在AISa-MGs过程富集，且其特异性拮抗剂CP96345可显著减弱视觉刺激诱导的小胶质细胞去极化。提示视觉刺激可能通过乙酰胆碱-毒蕈碱受体-NALCN轴激活小胶质细胞去极化。
AISa-MGs与锥体神经元的功能性相互作用调控相关神经元钙响应并影响视觉辨别行为
在体双光子钙成像显示，局部应用THIK-1拮抗剂C101248或光遗传学抑制小胶质细胞去极化活动，均能显著降低神经集群中对视觉刺激响应强烈的锥体神经元的钙瞬变峰值（ΔF/F）和频率，并破坏神经集群活动的同步性（Synchronicity）和连接度（Connectance）。通过免疫染色确认与AIS存在相互作用（AISa-PNs）和无相互作用（AISn-PNs）的锥体神经元，发现AISa-PNs对视觉刺激的钙响应更强烈，且此响应可被C101248特异性抑制或在小胶质细胞THIK-1 cKO后显著减弱。行为学实验表明，在成功训练小鼠进行视觉辨别（Go/No-Go）任务后，V1区注射C101248或小胶质细胞特异性THIK-1 cKO均能显著损害小鼠的任务表现。为特异性破坏AIS-MG物理相互作用，构建了小胶质细胞特异性Itgb1条件性敲除（Itgb1-cKO）小鼠，其AIS-MG相互作用比例显著降低。Itgb1-cKO同样导致强烈响应神经元的消失、神经集群同步性/连接度下降以及视觉辨别行为受损。这些结果直接证明了AIS-MG功能性相互作用在调控神经元活动及视觉感知行为中的关键作用。
讨论
本研究鉴定了一类与神经元AIS特异性相互作用的小胶质细胞（AISa-MGs），揭示了其短暂去极化活动通过THIK-1通道释放K+，直接作用于AIS局部以增强相关神经元兴奋性的新机制。研究进一步发现，生理性视觉刺激可通过毒蕈碱受体-NALCN轴诱发小胶质细胞过程特异性去极化，从而调控神经集群中关键神经元（AISa-PNs）的响应，影响整个神经网络的协同活动，最终调控视觉感知行为。该发现不仅拓展了对神经-免疫细胞相互作用复杂性的认识，也为理解小胶质细胞在高级脑功能中的主动调控作用提供了新的理论框架。这种基于AIS的、快速、灵活且精准的微环境调控机制，可能成为未来研究神经环路功能及相关神经系统疾病的新靶点。
