《Nature Biomedical Engineering》：High-efficiency TadA cytosine base editors for precise modelling of human disease variants
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本研究针对VUS功能验证的临床需求，开发了高效、精准的TadA衍生胞嘧啶碱基编辑器TCBE-Umax。通过优化TadA脱氨酶结构域，显著提升编辑效率、扩展PAM兼容性并降低indel形成，在斑马鱼F0代实现双等位基因编辑，成功评估15个遗传性听力损失相关VUS的致病性，为疾病基因功能研究和临床诊断提供强大平台。
随着临床基因组学的快速发展，越来越多的单核苷酸变异（SNV）被发现与人类疾病相关，但其中超过40%被归类为意义未明变异（VUS），这些变异既不能确定为良性也不能判断为致病性，成为临床诊断和遗传咨询的重要瓶颈。目前，数百万个VUS等待功能验证，严重阻碍了精准医疗的发展。斑马鱼因其与人类高度保守的基因组、快速发育和光学透明等优势，成为快速验证人类遗传变异功能的理想模型。
传统的CRISPR-Cas9技术虽然能够实现基因编辑，但双链断裂会引入不可控的插入缺失突变，而现有的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）存在编辑效率低、序列偏好性强、PAM限制严格以及高indel率等问题，限制了其在精准疾病建模中的应用。特别是对于需要在F0代进行直接表型评估的应用场景，现有工具的精度和效率均显不足。
为了解决这些挑战，研究人员开发了新一代TadA衍生的胞嘧啶碱基编辑器TCBE-Umax。该系统通过理性设计，在TadA脱氨酶结构域引入N46V、Y73P、V82S和Q154R等关键突变，显著提升了编辑效率，同时降低了序列背景偏好性。与传统的基于APOBEC1的CBE相比，TCBE-Umax不仅编辑窗口更宽（位置4-10），而且几乎完全消除了残留的A-to-G编辑活性，展现出优异的特异性。
在技术方法方面，研究团队通过密码子优化构建了TCBE-Umax系列编辑器，采用体外转录合成mRNA，通过显微注射方式将编辑器mRNA和sgRNA导入斑马鱼单细胞期胚胎。利用高通量测序和Sanger测序分析编辑效率，通过YO-PRO-1活细胞染色评估听觉毛细胞功能，结合声惊吓反应测试进行表型验证。研究还构建了TCBE-Umax-SpRY、TCBE-Umax-SpG和TCBE-Umax-NG等变体以扩展PAM识别范围，并开发了TCBE-Umax-ex1和TCBE-Umax-ex2等精度优化版本。
开发高效TadA衍生CBE编辑器
研究人员首先构建了四种新型编辑器（TCBE-1.1至TCBE-1.4），通过系统评估发现TCBE-1.2（命名为TCBE-Umax）表现最优，在25个内源性靶点中平均编辑效率达到89%，较之前的zTadCBE提升约2倍。重要的是，TCBE-Umax在不同序列背景下均保持稳定的编辑活性，且副产品（C-to-A和C-to-G转换）频率低于6%，显示出高特异性。
扩展TCBE-Umax的靶向范围
为突破PAM限制，研究团队将TCBE-Umax与SpRYCas9、SpGCas9和NG-Cas9结合，成功开发出可识别非典型PAM的编辑器变体。其中TCBE-Umax-SpRY在18个NNN PAM位点均检测到C-to-T转换，平均效率较zTadCBE-SpRY提高1.7倍。不同编辑器在特定基因座表现出互补的优势，为不同靶点提供了多样化选择。
表征两个具有降低indel生成和扩展靶向范围的TCBE-Umax编辑器
针对TCBE-Umax在某些位点诱导indel的问题，研究人员通过将脱氨酶插入Cas9的1054位点，开发了TCBE-Umax-ex1。该变体将编辑窗口扩展至位置3-12，同时将indel水平降低至TCBE-Umax的四分之一。而通过删除HNH结构域构建的TCBE-Umax-ex2，则将编辑窗口向PAM近端移动（位置5-16），在特定位点展现出卓越性能。
具有增强精度的三种TCBE-Umax编辑器表征
为减少旁观者编辑，研究团队开发了TCBE-Umax-rest1（N108Q突变）、TCBE-Umax-rest2（连接子删除）和TCBE-Umax-rest3（N119D/N122H/G125D突变）三种高精度版本。其中TCBE-Umax-rest2将编辑窗口限制在C4-C7，同时保持约75%的原始效率，在精度和效率间实现了最佳平衡。
使用TCBE-Umax对F0代候选疾病基因进行功能分析
研究人员应用TCBE-Umax成功建模了6个人类疾病基因的斑马鱼直系同源物，包括与Usher综合征相关的myo7aa和cdh23。通过引入提前终止密码子或错义突变，在F0代斑马鱼中重现了疾病表型，如听觉毛细胞功能异常、发育缺陷、脂质积累异常和肌肉发育障碍等，证明了该平台在快速评估VUS致病性方面的实用价值。
遗传性疾病相关变异的快速功能验证
研究团队进一步利用TCBE-Umax评估了15个与遗传性听力损失相关的VUS，其中14个来自ClinVar数据库。通过建立完整的筛选流程，在5-6天内即可完成从基因编辑到表型评估的全过程。结果显示，7个变异被鉴定为致病性，6个为良性，其余2个需要进一步验证。值得注意的是，针对TCBE-Umax编辑效率较低的位点，研究人员开发了TCBE-Umax2编辑器，通过引入N1317R和A1322R突变，将编辑效率提升2-15.5倍，成功解决了难编辑位点的评估问题。
该研究建立的TCBE-Umax平台不仅解决了现有碱基编辑工具在斑马鱼应用中的关键技术瓶颈，更重要的是为大规模、在体水平的功能性验证VUS提供了高效、可靠的技术手段。通过模块化设计策略，研究人员成功构建了具有不同特性的编辑器变体，用户可根据具体需求选择最适合的工具：对于需要高效率编辑的应用，TCBE-Umax是首选；对于高精度要求的场景，TCBE-Umax-rest系列更为合适；而对于非典型PAM位点，TCBE-Umax-SpRY等变体可提供有效解决方案。
这项研究成果发表于《Nature Biomedical Engineering》，标志着斑马鱼疾病建模和基因功能研究进入了新的发展阶段。TCBE-Umax系列编辑器的成功开发，不仅加速了我们对遗传变异功能的理解，也为未来个性化基因治疗的发展奠定了坚实的技术基础。随着更多疾病相关VUS的功能得到明确鉴定，这一技术平台有望在临床遗传诊断、药物筛选和精准医疗领域发挥越来越重要的作用。
