《Journal of Materials Chemistry B》：Systematic investigation of the effects of neural stem cell spheroid size and density on fate specification in 3D culture
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本研究系统探讨了小鼠神经干细胞（mNSC）球体尺寸（局部密度）与接种密度（全局密度）在透明质酸（HA）水凝胶三维（3D）培养体系中对细胞活力、增殖及分化的独立与交互影响。研究发现，拥有1000个总球体的培养条件最能维持细胞活力并促进神经元成熟，而低全局密度下的小球体培养则倾向于产生更多胶质细胞。此研究为精准调控3D培养中神经干细胞命运、可重复生成特定细胞群体用于体外（in vitro）测试床或治疗性干细胞生物制造提供了关键参数依据。
引言
中枢神经系统（CNS）疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病以及创伤性脑损伤和脊髓损伤，导致大量神经元和胶质细胞丧失，目前尚无有效的再生治疗方法。基于干细胞（stem cell）的疗法和体外（in vitro）疾病模型为CNS修复带来了希望，但移植细胞存活率和植入效率低是主要挑战。三维（3D）水凝胶支架，特别是模拟CNS细胞外基质（ECM）成分和力学特性的透明质酸（HA）水凝胶，为神经干细胞/祖细胞（NS/PCs）提供了更接近体内（in vivo）的微环境，有利于其存活和分化。与单细胞封装相比，将NS/PCs封装为球体（spheroids）或聚集体能增强细胞间相互作用、提高存活率、促进ECM沉积并实现更一致的分化。然而，球体尺寸（代表局部细胞密度）和整体接种密度（代表全局密度）如何共同影响NS/PCs在3D培养中的命运，尚缺乏系统研究。
实验材料与方法
本研究使用700 kDa的HA，通过碳二亚胺化学法引入硫醇基团（HA-SH），并与4臂聚乙二醇（PEG）交联形成水凝胶。水凝胶的HA浓度（0.5% w/v）和剪切模量（~200 Pa）旨在模拟天然CNS组织。水凝胶中还整合了RGD肽以促进细胞粘附。
从小鼠脊髓获取的神经干细胞（mNSCs）在AggreWell?400板中培养48小时，形成含有100个（小球体）或200个细胞（大球体）的球体。随后，将这些球体以低密度（100,000细胞/水凝胶）或高密度（200,000细胞/水凝胶）封装到HA水凝胶中进行3D培养，并在分化培养基中培养5天。
细胞活力通过TUNEL assay检测；细胞增殖通过Ki-67免疫染色和EdU assay结合流式细胞术评估；细胞分化状态通过免疫荧光染色检测多种标志物：SOX2（干细胞特性）、βIII-tubulin（未成熟/成熟神经元）、NeuN（成熟神经元）、GFAP（星形胶质细胞）和RIP/CNPase（少突胶质细胞）。图像分析使用CellProfiler软件，统计分析使用GraphPad Prism进行。
结果与讨论
球体尺寸在3D基质培养中大致均匀
在封装前，小球体（100细胞/球体）的平均直径为124 ± 11 μm，大球体（200细胞/球体）的平均直径为146 ± 13 μm，尺寸差异显著。相衬和Live/Dead染色图像显示球体在水凝胶内分布良好，24小时培养后显示出定性的活力。
最高存活率出现在总球体数为1000的条件下
培养5天后，TUNEL assay检测细胞凋亡。方差分析表明，球体尺寸、全局密度以及二者的交互作用均对凋亡有显著影响。事后分析显示，小球体在高全局密度（即总球体数2000/水凝胶）条件下凋亡细胞比例显著高于其他所有条件。而总球体数为1000的两个条件（小球体低密度和大球体高密度）的凋亡率显著低于总球体数为500和2000的条件，表明总球体数是影响3D培养存活率的关键因素。过高密度可能导致营养和氧气竞争加剧及活性氧（ROS）积累，而过低密度可能削弱了必要的旁分泌信号。
低全局密度下的小球体比其他条件下的细胞更具增殖性
通过Ki-67核表达评估增殖。全局密度对Ki-67阳性细胞比例有显著影响，球体尺寸与全局密度存在显著的交互作用。事后比较显示，小球体低密度条件下的Ki-67表达显著高于小球体高密度条件。这表明较高的局部或全局密度会抑制增殖。EdU assay（评估90分钟内进入S期的细胞）未检测到显著差异，约10%的细胞在检测期间发生增殖，而Ki-67标记所有细胞周期活跃期细胞，故比例更高（约40-60%）。
各条件下SOX2阳性NSC数量相似
SOX2是维持NSC多能性的关键转录因子。统计分析显示全局密度对SOX2阳性细胞数量有显著影响（低密度倾向于更多），但事后比较未发现组间显著差异。各条件下约40%的mNSCs表达SOX2，即使在缺乏有丝分裂原的分化培养基中也能维持一定的干细胞群体。
神经元分化在接种1000个球体的培养物中最大化
βIII-tubulin（未成熟/成熟神经元标记）阳性面积分析显示，球体尺寸、全局密度及其交互作用均有显著影响。小球体高密度条件的βIII-tubulin表达显著低于其他所有条件。NeuN（成熟神经元核标记）表达分析显示球体尺寸与全局密度存在显著交互作用，但组间无显著差异。趋势上，总球体数为1000的条件（小球体低密度和大球体高密度）的NeuN表达高于总球体数为500和2000的条件。这表明中等球体密度最有利于神经元分化，可能在营养可用性和旁分泌信号间取得平衡。
低全局密度培养物中GFAP阳性星形胶质细胞富集
GFAP（星形胶质细胞标记）阳性面积分析显示，全局密度有极显著独立影响，球体尺寸与全局密度存在显著交互作用。事后比较表明，低全局密度条件（无论球体大小）的GFAP表达显著高于高全局密度条件。低密度下可能因旁分泌支持不足而引发胶质细胞的应激反应，导致GFAP上调。
小球体在低全局密度下产生更多少突胶质细胞
RIP/CNPase（少突胶质细胞标记）阳性面积分析显示，球体尺寸、全局密度及其交互作用均显著。小球体低密度条件的RIP表达显著高于其他所有条件。值得注意的是，大球体高密度条件（同样是1000总球体）的RIP表达与小球体低密度条件最为接近，再次提示总球体数（1000）可能是促进少突胶质细胞分化的有利因素。
总体而言，数据表明球体间的平均距离是影响mNSC存活和命运的最重要因素
具体而言，拥有1000个总球体的条件在存活率和神经元/少突胶质细胞分化方面表现最佳，表明其平衡了营养竞争/废物交换与必要的旁分泌信号需求。尽管增殖和干性维持在各条件间差异相对较小，但球体尺寸和全局密度对细胞存活和分化的强烈影响表明这些效应独立于增殖和干性。Notch、Wnt/β-catenin和Hippo/YAP等接触和张力敏感的信号通路可能参与了这一密度依赖性调控。与依赖自组织的类器官相比，这种多球体水凝胶培养体系允许对球体大小、间距和密度进行系统控制，提高了可重复性，在药物筛选或生成同质神经细胞群体方面具有优势。未来的研究可探索更长的培养时间以观察细胞命运的长期变化，并使用生物打印等技术精确控制球体间距以更深入研究距离效应。
结论
本研究结果表明，封装在3D水凝胶中的mNSC球体密度强烈影响其存活和分化。球体尺寸和全局细胞密度存在强烈的交互作用，中等球体密度（每水凝胶1000个总球体）能最大化细胞活力并促进神经元和少突胶质细胞分化。这提示中等球体密度平衡了足够旁分泌信号与充足营养可用性/废物交换的需求。该研究为旨在控制神经干细胞命运的3D培养方案设计提供了关键框架。
