《Plant Biotechnology Journal》：The miR319/bHLH094 Module Regulates Creeping Bentgrass Thermotolerance by Modulating Auxin Biosynthesis and Signalling Pathway
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本研究揭示了miR319通过靶向bHLH094转录因子负调控匍匐剪股颖耐热性的新途径。该模块通过抑制生长素（IAA）生物合成与信号通路关键基因（如TARs、YUCCAs、Aux/IAAs、ARFs）的表达，降低内源生长素积累，从而削弱植物高温适应性。过表达AsbHLH094或外源施加IAA均可增强热耐受性，为改良冷季型草坪草抗逆性提供了新靶点。
引言
温度是调控植物生长发育的关键环境因子。高温胁迫会诱导蛋白质变性、加剧水分流失、破坏细胞膜完整性并促进有毒代谢物积累，最终导致植物死亡或发育异常。随着全球变暖加剧，提高作物的耐热性已成为重要研究方向。MicroRNA319（miR319）是一种在单子叶和双子叶植物中高度保守的miRNA，其已知靶标包括TCP和GAMYB转录因子家族成员。研究表明miR319参与植物对非生物胁迫的响应，但其在耐热性中的作用，尤其在冷季型禾草中的功能尚不清楚。
材料与方法
本研究以匍匐剪股颖品种Penn A-4为材料，通过农杆菌介导的遗传转化获得过表达水稻Osa-miR319b的转基因株系（OE319）。对野生型（WT）和转基因植株进行38°C热处理，测定相对电导率、叶绿素含量、相对含水量等生理指标。采用茎环RT-qPCR检测miR319表达量。通过psRNAtarget在线工具预测miR319的候选靶基因，并利用5′ RLM-RACE验证切割位点。利用酵母双杂交、双分子荧光互补和GST pull-down等技术验证蛋白互作。通过RNA测序分析差异表达基因，并利用GO和KEGG进行富集分析。采用液相色谱法测定内源生长素含量。
结果
miR319响应热胁迫并负调控耐热性
热胁迫（38°C）处理下，匍匐剪股颖叶片中成熟miR319的丰度显著降低，24小时内下降约40倍。过表达miR319的转基因株系在热处理后出现严重叶片萎蔫和黄化，存活率显著低于WT。生理指标显示，OE319植株的相对含水量和叶绿素含量显著下降，相对电导率和H2O2含量显著上升，表明其细胞膜受损更严重，抗氧化能力更弱。
AsbHLH094是miR319的直接靶标
生物信息学分析鉴定出AsbHLH094、AsGAMYB、AsPCF5等6个候选靶基因。qRT-PCR显示这些基因在OE319植株中的表达均显著下调。热处理下，仅AsbHLH094表达量随时间推移逐渐上升，与miR319表达模式呈负相关。5′ RLM-RACE证实miR319在AsbHLH094转录本561-581 bp处（距起始密码子3 bp上游）进行切割。双荧光素酶报告基因实验和烟草瞬时表达实验进一步验证了miR319对AsbHLH094的靶向关系。
AsbHLH094与AsIAA1互作并正调控耐热性
亚细胞定位显示AsbHLH094和AsIAA1均定位于细胞核。酵母双杂交、LCI和GST pull-down实验均证实两者存在物理相互作用。在烟草中过表达AsbHLH094显著增强了植株的耐热性，表现为热处理后植株保持更绿、生长更旺盛，相对含水量和叶绿素含量更高，相对电导率和H2O2积累更少。
miR319-AsbHLH094模块通过生长素通路调控耐热性
RNA-seq分析发现，OE319植株中多个生长素生物合成基因（TARs、YUCCAs）和响应基因（Aux/IAAs、ARFs）表达下调，导致内源生长素（IAA、IBA、IAA-Ala）积累减少。相反，过表达AsbHLH094可促进生长素积累及相关基因表达。外源施加10-5M IAA能显著提高WT植株的耐热性。这些结果表明，miR319通过抑制AsbHLH094表达，进而负调控生长素生物合成与信号通路，最终降低匍匐剪股颖的耐热性。
讨论
本研究首次揭示了miR319-AsbHLH094模块在匍匐剪股颖耐热性中的负调控作用。AsbHLH094通过与AsIAA1互作，可能竞争性结合AsIAA1，从而释放ARF转录因子，激活下游生长素响应基因表达，增强耐热性。该调控模块与拟南芥中PIF4通过生长素通路调控热形态建成的机制类似，为理解单子叶植物耐热机制提供了新视角。研究结果为通过遗传改良提高冷季型草坪草的耐热性提供了潜在靶点。
