《Journal of Advanced Research》：EVA1A responds to endoplasmic reticulum stress to regulate renal fibrosis by promoting TGF-β signaling pathway
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本文聚焦慢性肾脏病（CKD）中肾纤维化的关键调控机制。研究人员发现内质网（ER）应激通过转录因子CHOP上调跨膜蛋白EVA1A的表达；EVA1A进而与分子伴侣BIP相互作用，稳定TGF-β受体II型（TGFBR2）并促进其从内质网向质膜转运，从而增强TGF-β信号通路活性，最终加剧肾纤维化。该研究揭示了ER应激与TGF-β信号通路交互作用的新机制，为靶向EVA1A治疗CKD提供了潜在新策略。
肾脏，这个形如蚕豆的精密器官，默默承担着人体代谢废物和维持内环境稳定的重任。然而，当各种损伤因素持续作用，慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD）便悄然发生，其典型的病理特征——肾纤维化，如同器官上无法消退的“疤痕”，会逐渐取代健康的肾单位，导致肾功能不可逆地丧失，最终走向终末期肾病。目前，针对肾纤维化的有效治疗手段依然匮乏，深入探索其发生发展的细胞分子机制，是开发新疗法的关键。
在肾纤维化的复杂调控网络中，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）信号通路被公认为核心驱动力。另一方面，细胞内的一种重要应激反应——内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress），也被发现在CKD中异常激活，并与疾病进展密切相关。然而，内质网应激如何精确地影响TGF-β信号通路，从而推动肾纤维化进程，其间的具体分子桥梁尚不清晰。发表在《Journal of Advanced Research》上的一项研究，正是为了揭开这个谜团。研究人员将目光投向了一个名为EVA-1同源物A（EVA-1 homolog A, EVA1A）的内质网跨膜蛋白，系统性地探讨了它在肾纤维化中的作用及其分子机制。
为了回答上述科学问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在临床相关性分析方面，他们利用了公共数据库（如Nephroseq）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和人类肾组织样本进行生物信息学分析和免疫组化验证。在机制探索上，研究构建了全身性诱导性敲除和肾近端小管特异性敲除Eva1a的小鼠模型，并应用了单侧输尿管结扎（UUO）和单侧缺血再灌注损伤（UIRI）这两种经典的CKD小鼠模型来模拟肾纤维化。细胞水平的研究使用了人肾近端小管上皮细胞系（HK2）、人胚胎肾细胞系（HEK293T）以及从小鼠分离的原代肾小管上皮细胞，通过基因敲减、过表达、药物（如TGF-β1、衣霉素TG、蛋白酶体抑制剂MG132）处理等进行功能获得和功能缺失实验。在分子机制层面，研究人员采用了免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）、流式细胞术、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光、免疫组化以及质谱分析等技术，深入探究了EVA1A与TGFBR2、BIP之间的相互作用，以及对TGFBR2稳定性、膜定位和下游信号通路的影响。
EVA1A在CKD患者和小鼠纤维化肾脏中表达上调
研究人员首先通过分析公共数据库和临床样本发现，与健康供者相比，EVA1A在CKD患者的肾脏，特别是在肾近端小管中表达显著升高，且其表达水平与纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原I（Collagen-I）呈正相关。在UUO和UIRI诱导的CKD小鼠模型肾脏中，EVA1A的蛋白水平也显著增加，这与纤维化进程同步。
敲除Eva1a减轻CKD小鼠模型中的肾纤维化
为了明确EVA1A的功能，研究团队构建了Eva1a敲除小鼠。在UUO和UIRI模型中，与野生型（WT）小鼠相比，Eva1a敲除显著减轻了肾损伤（表现为肾脏损伤分子1 KIM-1、血尿素氮BUN和血清肌酐水平降低）和肾纤维化（表现为纤维连接蛋白FN、α-SMA、胶原I等表达下降）。组织染色结果（如Masson染色、HE染色）也直观地证实了Eva1a缺失对肾纤维化和组织损伤的缓解作用。
肾近端小管特异性敲除Eva1a减轻肾纤维化
通过分析单细胞数据库和免疫荧光定位，研究人员发现EVA1A在肾近端小管中高表达。他们进一步构建了肾近端小管特异性敲除Eva1a的小鼠（Eva1aP-/P-）。在这些小鼠中，UUO和UIRI诱导的肾纤维化和损伤同样得到显著缓解，这表明EVA1A在肾近端小管中发挥着关键的促纤维化作用。
过表达EVA1A加重UUO小鼠模型的肾损伤和纤维化
相反，在UUO小鼠模型中通过尾静脉注射过表达EVA1A，则加剧了肾纤维化和损伤，纤维化标志物和损伤标志物的表达进一步升高。这一正反实验结果表明，EVA1A是肾纤维化的一个重要促进因子。
内质网应激通过CHOP上调CKD中的EVA1A表达
机制探索的第一步是弄清EVA1A为何在CKD中升高。研究人员发现，在UUO模型小鼠肾脏中，内质网应激相关蛋白（如CHOP、IRE1α、BIP、ATF4）的表达与EVA1A同步上调。在体外，用衣霉素（TG）诱导内质网应激后，野生型原代肾小管细胞中EVA1A表达增加，但在Chop基因敲除的细胞中则无此现象。在体实验中，Chop基因敲除也能抑制UUO诱导的EVA1A上调及随后的肾纤维化。这些结果说明，CKD中的内质网应激通过转录因子CHOP上调了EVA1A的表达。
Eva1a缺陷抑制CKD中的TGF-β信号通路
为了解EVA1A如何促进纤维化，研究人员对小鼠肾脏组织进行了RNA测序分析。基因集富集分析（GSEA）显示，在Eva1a敲除的UUO小鼠肾脏中，TGF-β信号通路显著下调。细胞实验表明，在TGF-β1刺激下，Eva1a敲除的原代肾小管细胞中磷酸化SMAD2/3（p-SMAD2/3，TGF-β通路下游关键信号分子）水平、TGFBR2蛋白水平以及纤维化标志物表达均低于野生型细胞。而过表达EVA1A则增强了下游信号。在体实验也证实，Eva1a敲除降低了UUO小鼠肾脏中TGFBR2蛋白水平和p-SMAD2水平，而过表达EVA1A则产生相反效果。值得注意的是，Tgfbr2的mRNA水平未受影响，提示EVA1A在蛋白质层面进行调控。
Eva1a缺陷损害TGFBR2的质膜定位和蛋白质稳定性
进一步机制研究表明，Eva1a敲除导致TGFBR2在细胞膜表面的定位减少，而在内质网中积聚。同时，TGFBR2的泛素化修饰增强，蛋白质稳定性下降。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理，可以恢复Eva1a敲除细胞中TGFBR2的总量和膜定位，并部分恢复TGF-β信号通路活性和纤维化蛋白表达。这表明EVA1A通过抑制泛素-蛋白酶体途径的降解来稳定TGFBR2。
EVA1A通过其N端结构域在内质网中与TGFBR2相互作用，影响TGF-β信号通路的激活
通过免疫共沉淀和双分子荧光互补（BiFC）实验，研究人员证实EVA1A与TGFBR2在内质网中存在直接相互作用。结构域分析发现，EVA1A的N端结构域对其与TGFBR2的结合至关重要。表达缺失N端结构域的EVA1A突变体（ΔN）无法有效促进TGF-β信号通路激活。
BIP参与EVA1A与TGFBR2的相互作用及后续TGF-β信号通路的激活
质谱分析和免疫共沉淀实验发现，内质网分子伴侣BIP（也被称为GRP78）与EVA1A和TGFBR2都存在相互作用。敲低EVA1A会减少BIP与TGFBR2的结合，而敲低BIP则会削弱EVA1A与TGFBR2的相互作用，并抑制EVA1A过表达所促进的TGFBR2膜定位和TGF-β信号通路激活。这表明BIP作为桥梁，协助EVA1A稳定TGFBR2并促进其向膜转运。
综上所述，本研究揭示了一条连接内质网应激与TGF-β信号通路、驱动肾纤维化的新轴线：在CKD进程中，内质网应激通过CHOP上调EVA1A的表达；升高的EVA1A作为适配体，招募分子伴侣BIP，共同与TGFBR2形成复合物，从而稳定TGFBR2蛋白，促进其从内质网向细胞膜的正常转运；膜上TGFBR2的增加增强了细胞对TGF-β因子的响应，进而激活下游SMAD信号，最终导致细胞外基质过度沉积和肾纤维化。
这项研究的重大意义在于，它不仅阐明了EVA1A在肾纤维化中的关键作用和非自噬/凋亡依赖的新功能，更重要的是，它揭示了内质网应激调控TGF-β信号通路的一个精细的分子机制，为理解CKD的发病机制提供了新的视角。鉴于直接靶向TGF-β信号通路可能带来较大副作用，本研究提示EVA1A可能成为一个更有选择性、更安全的治疗肾纤维化和CKD的潜在新靶点。未来的研究可以致力于开发特异性抑制EVA1A功能或其与TGFBR2相互作用的药物，为攻克这一重大慢性疾病带来新的希望。
