通过超声提取和自动固相萃取（SPE）净化后，利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）对海洋沉积物中的喹诺酮类药物进行精确定量分析

《Journal of Chromatography A》：Accurate quantification of quinolones in marine sediment by UPLC-MS/MS after ultrasonic extraction and automated SPE clean-up

本研究开发了一种基于超声提取结合自动固相萃取和超高效液相色谱-串联质谱的高效分析方法，用于海洋沉积物中15种喹诺酮类抗生素的准确测定。方法通过同位素稀释校正消除基质效应，检出限低至2-15 pg/g，回收率85%-119%。在浙江东部海域沉积物中检测到左氧氟沙星等5种QNs，总浓度5.6-12.1 μg/kg（Yueqing Bay）和0.2-1.0 μg/kg（Daiquyang），左氧氟沙星为主要污染物。

　　

李振华|赵巧玲|赵浩基|李铁军|胡洪梅|郭远明|程海勇

浙江省渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江省海洋渔业研究院，舟山316021，中国。

摘要

喹诺酮类（QNs）是一类最常用的广谱抗生素，在各种环境基质中普遍存在（尤其是在海洋沉积物中）。然而，由于基质复杂性和喹诺酮类与沉积物的强吸附作用，测定海洋沉积物中的多种喹诺酮类化合物是一项具有挑战性的任务。本文提出了一种高效定量策略，通过使用0.2 M Na₂HPO₄和50 v/v %乙腈进行超声提取，随后进行自动化固相清洗和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析，并采用同位素稀释校准方法，实现对海洋沉积物中15种喹诺酮类化合物的准确测定。该方法表现出可忽略的基质效应、令人满意的回收率（85%–119%）以及较低的检测限（2–15 pg/g）。在越清湾和戴渠洋的海洋沉积物中检测到了五种喹诺酮类化合物，其总浓度分别为5.6–12.1 μg/kg和0.2–1.0 μg/kg，其中四种化合物（诺氟沙星（NOR）、恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星）在所有样本中均有检出，且诺氟沙星在越清湾和戴渠洋中的含量最高。总体而言，所提出的方法对于海洋沉积物中喹诺酮类化合物的常规分析具有高度敏感性和可靠性。

引言

喹诺酮类（QNs）是一类在人类和兽医医学领域广泛应用的重要广谱抗生素，因其具有高效的抗菌活性、良好的代谢稳定性、低成本合成以及与其他抗菌药物无交叉耐药性[1]。然而，大多数喹诺酮类化合物无法完全代谢，并在全球各种环境基质（如水、土壤、沉积物和生物体）中普遍存在[1,2]。抗生素的急性和慢性暴露可能对非目标生物造成有害影响，并促进抗生素抗性基因的发展[3]。多项研究表明，沉积物是喹诺酮类化合物的重要储存库，沉积物中的喹诺酮类化合物浓度通常比水环境中的浓度高3–4个数量级[1,4]。尽管如此，由于沉积物基质的复杂性和对喹诺酮类化合物的强吸附性，准确监测沉积物中的喹诺酮类化合物仍然具有挑战性[5,6]。

目前，用于沉积物中喹诺酮类化合物定量分析的主要技术包括基于高效液相色谱（HPLC）与紫外（UV）、荧光[7,8]和质谱（飞行时间高分辨率质谱（TOF-MS）[9,10]、混合四极杆-高分辨率Orbitrap质谱（Q-Orbitrap-MS）[11]以及串联质谱（MS/MS）[2,6,[12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30]）的方法。然而，这些方法通常只能检测有限数量的喹诺酮类化合物（通常为1种[9]至10种[34]）。数据不足可能源于从沉积物中提取喹诺酮类化合物的困难，或者检测限（LODs）与环境水平不匹配。由于喹诺酮类化合物与样品基质的亲和力较高，因此在仪器分析之前需要一种有效且稳健的提取技术。现有的提取方法主要使用单一有机溶剂（如乙腈或甲醇）或混合溶剂（如乙腈或甲醇与酸性缓冲液和Na₂EDTA的混合物）结合摇动提取[2,15,17,[18], [19], [20]]、超声提取（USE）[6,[8], [9], [10],[12], [13], [14], [15], [16]], [17], [18],[20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27],29,30]、微波辅助提取（MAE）[7,11]和加压液相提取（PLE）[28,[31], [32], [33]来提高提取效率。提取完成后，向提取液中加入200–500 mL或更多的超纯水，通过固相萃取（SPE）[[6], [7],[12], [13], [14], [15], [16]], [17], [18],[20], [21], [22], [23],27,29,32]进一步浓缩和纯化样品。然而，现有的单一/混合有机溶剂在酸性条件下对某些实际沉积物样本中的喹诺酮类化合物提取效率较低[[31], [32], [33]]，这可能无法反映其实际检出频率。例如，Chabilan等人提出了一种使用乙腈/50 mM磷酸（pH=2）（1:1, v/v）作为提取溶剂的PLE-SPE-LC-MS/MS方法，用于测定河流沉积物中的环丙沙星（CIP）、克林沙星（CLI）、恩诺沙星（ENR）、诺氟沙星（NOR）和氧氟沙星（OFL），其检测限范围为0.2–58 μg/kg。但在添加50 μg/kg和100 μg/kg的 spiked水平下，CIP、ENR、NOR和OFL的回收率仅为0.2%至1.9%，而CLI未检出[33]。Rashid等人的研究也得到了类似结果，他们使用0.1 M Na₂EDTA Mcllvaine缓冲液（pH 4.0）和MeOH/ACN（1:3, v/v）依次提取沉积物，然后进行分散SPE-LC-MS/MS分析，得到10种目标化合物的检测限为0.04–13.8 μg/kg。此外，还需要额外加入200–500 mL超纯水进行SPE清洗，这会增加提取时间（> 130分钟）。最重要的是，这种方法对大多数喹诺酮类化合物存在基质效应（ME），因此需要采用外部基质匹配校准和同位素标记内标（ILISs）校准等定量方法[[31], [32], [33], [34]]。然而，仅有少数ILISs被用于校正基质效应，且某些化合物的回收率不理想[35]。

本研究旨在开发一种快速分析方法，利用超声提取后自动SPE-UPLC-MS/MS技术定量海洋沉积物中具有不同理化性质的多种喹诺酮类化合物。比较了不同的提取剂和溶剂以及SPE清洗条件，并通过15种ILISs消除了基质效应。最后，将该方法应用于从中国东海越清湾和戴渠洋采集的海洋沉积物样本，阐明了目标喹诺酮类化合物在这些海域中的初步分布情况。

化学物质和试剂

表1中列出的15种目标喹诺酮类化合物的标准混合溶液（每种100 mg/L）及其对应的同位素标记内标（ILISs）来自Alta Scientific（天津，中国）。色谱用甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和甲酸由Fisher（比利时Geel）提供。磷酸二钠、乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）、六水合硝酸镁和氯化钠由中国药科大学试剂有限公司（北京，中国）提供。氨溶液（25%）

超声提取溶剂的优化

在我们之前的研究[35]中，我们开发了一种用于环境水中喹诺酮类化合物定量分析的UPLC-MS/MS方法，该方法适用于自动SPE富集后的样品。然而，由于喹诺酮类化合物与固体基质的紧密结合，该方法不适用于沉积物中的喹诺酮类化合物定量。因此，本研究重点关注从沉积物中提取喹诺酮类化合物，并在定量前对提取的沉积物溶液进行自动SPE清洗

结论

本研究提出了一种基于超声提取、自动SPE清洗和UPLC-MS/MS定量技术的海洋沉积物中15种喹诺酮类化合物的分析方法。与许多实验室常用的样品提取和清洗技术相比，我们简化了提取溶剂，减少了稀释体积和时间消耗，从而实现了高灵敏度、选择性、良好的准确性和精度，适用于海洋沉积物样本的分析。

作者贡献声明

李振华：撰写——原始稿件、资源获取、数据管理、概念构建。赵巧玲：验证、数据管理。赵浩基：验证、数据管理。李铁军：资源获取、资金筹集。胡洪梅：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、监督、项目管理、方法论、资金筹集、概念构建。郭远明：资源获取、概念构建。程海勇：撰写——审阅与编辑、数据可视化、监督、项目管理

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国浙江省科学技术项目（项目编号LTGC24B050013）和中国舟山市科学技术项目（项目编号2024C31044和2021C31011）的支持。