《Advanced Science》：Competition Between Liquid-Liquid Crystalline Phase Separation (LLCPS) and Liquid-Liquid Phase Separation (LLPS) in Amyloid Fibril Colloidal Systems
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本综述系统阐述了淀粉样蛋白原纤维在液相分离（LLPS）和液晶相分离（LLCPS）之间的竞争机制。研究以溶菌酶和β-乳球蛋白淀粉样原纤维为模型，揭示了pH值通过调控原纤维表面电荷密度，主导相分离路径从熵驱动的LLCPS（形成向列相液晶）向焓驱动的LLPS（形成无序凝聚体）转变的规律。这项工作为理解功能性及病理性淀粉样蛋白凝聚体的介观组织提供了物理框架，并为设计多相淀粉样基材料提供了控制策略。
淀粉样蛋白原纤维是刚性、细长的蛋白质聚集体，可在功能性生物组装体和病理性沉积物中形成凝聚相。从胶体物理学的视角来看，两条主要的相分离路径可导致这些凝聚相的形成：液相分离（LLPS），源于熵和焓之间的权衡；以及液晶相分离（LLCPS），这是一个本质上由熵驱动的过程，其中凝聚相是遵循精确对称规则的向列相液晶。本研究旨在阐明淀粉样蛋白原纤维分散体系中这两种路径的相互作用与竞争关系。
研究模型与表征
研究选用鸡卵清溶菌酶和β-乳球蛋白形成的淀粉样蛋白原纤维作为模型系统。原子力显微镜（AFM）表征显示，溶菌酶原纤维在pH 2.0至8.0范围内保持结构稳定，具有高长径比（≈95）和刚性（Lp/Lc? 1）。动态光散射（DLS）和电泳迁移率测定表明，原纤维的胶体稳定性和线性电荷密度具有pH依赖性。溶菌酶原纤维的等电点约为pH 10，其线性电荷密度随pH升高从3.0 e/nm降至约1.17 e/nm（pH 7.0）。β-乳球蛋白原纤维表现出相似的趋势，等电点约为pH 5.0。
液晶相分离（LLCPS）的主导作用
在酸性条件下（如pH 2.0），溶菌酶原纤维溶液在浓度超过约1.49 wt%时，发生从各向同性相到各向同性-向列相共存的LLCPS。交叉偏振光学显微镜观察到了典型的向列相液晶液滴（Tactoids），包括均匀、双极和胆甾型液滴。三维交叉相关动态光散射（3D Cross-Correlation DLS）揭示了在相共存区域存在快速（自由扩散）和慢速（受限于液晶液滴内）两种扩散模式。荧光漂白恢复（FRAP）实验进一步证实了原纤维在液晶液滴内的流动性。小角X射线散射（SAXS）分析显示，在较高浓度下（3.0-5.0 wt%），出现了与向列相有序相关的结构因子峰，对应原纤维间距约为20.9 nm。这些现象主要由熵驱动的排除体积效应所主导，符合刚性带电棒状粒子的经典理论。
向液相分离（LLPS）的转变
随着pH值升高（接近原纤维的等电点），相行为发生显著变化。对于溶菌酶原纤维，当pH升至8.0（线性电荷密度≈1 e/nm）时，体系从LLCPS转变为LLPS。此时，交叉偏振显微镜下观察到的是大的、不规则的微观凝聚体，其内部虽包含多个双折射区域，但缺乏连贯的向列相有序性（即没有明确的指向矢场）。这些LLPS形成的凝聚体具有流体特性，可通过稀释或重新酸化可逆地恢复为各向同性相。FRAP显示其内部原纤维的表观扩散系数与液晶液滴中相似，但可移动分数显著降低，表明存在吸引相互作用导致的表观弹性。SAXS谱在低q值出现显著上扬，反映了凝聚体内的原纤维组织。β-乳球蛋白原纤维在pH 5.0时也表现出类似的从LLCPS到LLPS的转变。
相图与竞争机制
研究构建了溶菌酶和β-乳球蛋白淀粉样原纤维的浓度-pH相图。相图清晰地展示了三个区域：低浓度、低pH下的各向同性区；高浓度、低pH下的各向同性-向列相共存区（LLCPS主导）；以及高浓度、高pH（近等电点）下的LLPS区。关键发现包括：
- 1.
LLCPS的起始浓度随pH升高而降低。这是由于pH升高减少了净电荷密度，但通过透析降低离子强度会增大德拜长度，从而增大了原纤维的有效直径（Deff）和排除体积，使得在更低浓度下即可发生熵驱动的向列相有序化。
- 2.
在临界pH阈值（溶菌酶pH 8.0，β-乳球蛋白pH 5.0）附近，发生从LLCPS到LLPS的转变。当电荷密度足够低时，吸引性的范德华相互作用克服静电排斥，使得焓驱动的各向同性相分离（LLPS）取代熵驱动的液晶相分离（LLCPS）成为主导。配对相互作用势垒计算支持了这一机制。
结论与意义
研究表明，淀粉样蛋白原纤维的相行为是LLCPS和LLPS之间复杂相互作用的结果，并可通过pH等简单溶液条件进行调控。熵驱动的LLCPS在宽pH范围内占主导，而形成有序向列相；而近等电点时，焓驱动的LLPS则导致形成无序但局部仍具双折射的凝聚体。这种相分离路径的竞争与调控机制，不仅为理解功能性（如支架材料）和病理性（如蛋白沉积）淀粉样蛋白凝聚体的介观组织提供了新的物理见解，也为设计具有可调结构和性能（如各向异性力学、可逆封装）的多相淀粉样基材料（如水凝胶、递送平台）奠定了理论基础。
