《Advanced Science》：Non-Targeting shRNA-Encoded Plasmid DNA Enhances Protective Immunity Through RIDD-RIG-I Signaling Pathway in the Zika Virus Animal Model
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本研究开发了一种新型寨卡病毒(ZIKV)DNA疫苗，通过引入非靶向短发夹RNA(shRNA)作为分子佐剂，创新性地利用IRE1α依赖性调节性IRE1依赖性衰减(RIDD)通路激活RIG-I信号，显著增强了疫苗的免疫原性。该策略在不靶向宿主基因的前提下，通过扰动RNA沉默稳态触发先天免疫应答，为寨卡病毒等传染病的疫苗研发提供了安全有效的佐剂平台。
研究背景与意义
DNA疫苗因其生产成本低、制备快速、稳定性好等优势，在应对热带和新发传染病方面展现出巨大潜力。然而，其在人体中的免疫原性有限，往往需要多次加强免疫或高剂量抗原，这严重限制了其广泛应用。寨卡病毒作为黄病毒属成员，曾在2015-2016年在热带和亚热带地区引起大流行，是DNA疫苗开发的理想靶标。
非靶向siRNA的免疫刺激作用机制
研究发现，非靶向siRNA能够激活树突状细胞的免疫应答。实验显示，转染非靶向siRNA-1和siRNA-2可显著诱导JAWSII小鼠树突状细胞分泌IL-6、TNFα和IL-1β等细胞因子，并上调mBMDC表面MHC-II、CD40、CD80和CD83等共刺激分子的表达。其中NTsiRNA-2表现出更强的免疫激活潜力，因此被选为后续研究的候选分子佐剂。
转录组学分析进一步揭示了非靶向siRNA的作用机制。RNA测序和基因集富集分析表明，非靶向siRNA处理可特异性激活"RNA沉默机制与加工"相关通路，引起Ago、Tnrc6、Drosha和Dicer等RISC核心组分的转录上调。值得注意的是，该过程选择性激活了IRE1α-RIDD通路，而非典型的未折叠蛋白反应。Western blot实验证实，非靶向siRNA可诱导IRE1α在Ser724位点的磷酸化，上调TXNIP表达，同时降低GRP78水平。
RIDD-RIG-I信号轴的验证
机制研究表明，非靶向siRNA通过RIDD通路产生免疫刺激性RNA片段，进而激活RIG-I及其下游信号。在HEK-Lucia RIG-I报告细胞中，非靶向siRNA-2可显著增强荧光素酶活性，且这一效应可被IRE1α激酶抑制剂GSK2850163、IRE1α RNase/RIDD抑制剂4μ8C以及RIG-I抑制剂RIG012以剂量依赖性方式抑制，证实了IRE1α-RIDD-RIG-I信号轴的级联关系。
DNA疫苗构建与免疫效果评估
基于上述发现，研究团队构建了包含寨卡病毒结构蛋白(prME)和U6启动子驱动的非靶向shRNA的DNA疫苗pVax-NTsh-prME。在C57BL/6小鼠模型中，该疫苗在低剂量(5μg)下即可诱导强烈的寨卡病毒特异性体液和细胞免疫应答，产生的抗Env IgG抗体滴度和中和抗体水平显著高于不含佐剂的对照组，且效果与8倍剂量(40μg)的传统DNA疫苗相当。
细胞免疫方面，pVax-NTsh-prME免疫小鼠的脾细胞在Env蛋白重刺激下，可产生更高水平的IFN-γ和IL-2，并通过ELISpot检测到更多的IFN-γ分泌细胞。在TLR3-/-、MAVS-/-和Casp1-/-基因敲除小鼠中的实验进一步证实，非靶向shRNA的佐剂效应依赖于MAVS和Caspase-1信号通路，而不依赖于TLR3。
保护效力验证
在易感的AGB6小鼠(缺乏I型和II型干扰素受体)攻毒实验中，pVax-NTsh-prME疫苗表现出剂量依赖性的保护效果。与对照组相比，免疫小鼠在寨卡病毒攻击后病毒血症显著降低，生存率明显提高。当疫苗剂量增加至20μg时，可完全抑制病毒复制，并提供100%的保护率。重要的是，通过共注射prME编码质粒和不同剂量的非靶向shRNA表达载体，研究证实保护效果与shRNA体内表达水平直接相关，排除了载体骨架中CpG序列的非特异性影响。
研究意义与展望
该研究创新性地将非靶向shRNA作为DNA疫苗的内源性分子佐剂，通过调控IRE1α-RIDD-RIG-I信号轴增强免疫应答，为解决DNA疫苗免疫原性不足的瓶颈问题提供了新策略。这种不依赖特定序列设计、不靶向宿主基因的佐剂平台，具有更好的安全性和通用性，为传染病疫苗和肿瘤免疫治疗的发展开辟了新途径。
