《Advanced Science》：Synergistic Activation of Immunogenic Cell Death and the cGAS–STING Pathway by Engineered Zinc/Manganese-Based Metal–Organic Framework Nanoplatforms for Colon Cancer Immunotherapy
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本研究开发了一种新型pH/GSH双响应性纳米平台AMP@Zn/Mn-MOF，该平台通过协同激活cGAS-STING通路和诱导免疫原性细胞死亡（ICD），显著增强了结肠癌的免疫治疗效果。该纳米颗粒兼具过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽氧化酶（GSHox）模拟活性，能有效产生活性氧（ROS）并消耗谷胱甘肽（GSH），从而触发强大的抗肿瘤免疫反应。当与抗PD-L1（αPD-L1）抗体联用时，可重塑免疫抑制肿瘤微环境（TME），有效抑制原发瘤和远端瘤生长，为基于免疫检查点阻断（ICB）的结肠癌免疫治疗提供了新策略。
1 引言
结肠癌（Colon Cancer, CC）是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。目前，手术切除联合术后化疗是主要治疗手段，但5年生存率仅约60%。免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法，如针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡受体-1（PD-1）及其配体（PD-L1）的抗体，在结肠癌治疗中取得了突破性进展，但其疗效受限于免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），且仅有少数患者能从中长期获益。因此，开发新的联合治疗策略至关重要。
先天免疫的激活是提高肿瘤免疫治疗效果的有效策略。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cyclic GMP-AMP Synthase–Stimulator of Interferon Genes, cGAS–STING）通路是先天免疫系统的关键组成部分，已成为肿瘤治疗的一个有前景的靶点。cGAS能识别胞质中的双链DNA（dsDNA）并合成cGAMP，后者激活STING，进而产生I型干扰素（IFN-I）和促炎细胞因子，触发抗肿瘤先天免疫反应。STING激动剂在增强结肠癌免疫刺激方面显示出潜在疗效。
金属有机框架（Metal–Organic Frameworks, MOFs）作为一种多孔材料，由有机配体和配位金属离子/簇构成，具有合成简便、热稳定性好、可实现靶向给药等优点。研究表明，锌离子（Zn2+）和锰离子（Mn2+）在胞质中的积累能增强cGAMP合酶活性，从而通过STING依赖性途径激活先天免疫反应。然而，Zn2+或Mn2+的直接临床应用因其显著的毒副作用而受到限制。尽管已开发出各种Zn2+/Mn2+配位的纳米颗粒用于递送这些离子，但关于Zn/Mn修饰的MOFs在免疫治疗中应用的研究仍较少。此外，许多天然或合成的STING激动剂虽在临床前试验中显示出良好的有效性和耐受性，但也面临酶降解快、清除迅速、靶向性差和不稳定等挑战。
为解决上述问题，本研究开发了一种负载STING激动剂c-di-AMP二铵的Zn/Mn-MOF纳米平台（AMP@Zn/Mn-MOF）。该平台能协同激活cGAS-STING通路和诱导免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD），从而增强抗肿瘤免疫反应，并与αPD-L1抗体联合产生显著的远端抑瘤效应。
2 结果与讨论
2.1 AMP@Zn/Mn-MOF的构建与表征
Zn/Mn-MOF通过Zn(NO3)2、Mn(NO3)2和2-甲基咪唑（2-MIM）在甲醇中自组装合成。为降低Zn2+/Mn2+的细胞毒性并有效激活cGAS-STING信号，将STING激动剂c-di-AMP二铵封装到Zn/Mn-MOF中，随后用聚乙二醇（PEG）修饰其表面以增强胶体稳定性和生物相容性。扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS） mapping显示AMP@Zn/Mn-MOF呈单分散多面体形态。原子力显微镜（AFM）图像显示其具有类似六边形的形态，平均厚度约为200 nm，与流体动力学尺寸测量结果一致。负载c-di-AMP二铵后，纳米颗粒的Zeta电位从+26 mV变为+10 mV。X射线衍射（XRD）图谱证实c-di-AMP二铵修饰未改变Zn/Mn-MOF的晶体结构。傅里叶变换红外（FTIR）光谱和X射线光电子能谱（XPS）分析均证明了c-di-AMP二铵的成功负载。药物负载量（LC%）约为40.48%。Brunauer?Emmett?Teller（BET）分析和孔径分布曲线显示Zn/Mn-MOF具有多孔结构，比表面积为1249.78 m2/g，Barrett?Joyner?Halenda（BJH）孔径为2.1 nm。电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）分析显示AMP@Zn/Mn-MOF中Mn的实际含量[Mn/(Mn+Zn)]为6.1%。这些结果证实了AMP@Zn/Mn-MOF的成功制备。
2.2 细胞摄取与细胞毒性
通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Zn/Mn-MOF（FITC@Zn/Mn-MOF）能有效被小鼠结肠癌细胞（MC38）摄取，并在溶酶体中观察到强烈的绿色荧光信号。ICP–MS进一步定量证实，FITC@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞内Zn2+/Mn2+含量显著高于PBS组，流式细胞术分析也验证了这一结果，表明Zn/Mn-MOF可作为有前景的纳米载体用于有效药物递送。
钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）染色显示，AMP@Zn/Mn-MOF处理组活细胞/死细胞比率降低，表明其对MC38细胞具有细胞毒性。细胞形态观察显示AMP@Zn/Mn-MOF处理导致细胞膜完整性破坏。Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术分析进一步证实，AMP@Zn/Mn-MOF能显著增加坏死细胞比例。在三维（3D）肿瘤球体模型中，AMP@Zn/Mn-MOF能显著抑制MC38肿瘤球的生长。长期集落形成实验表明，AMP@Zn/Mn-MOF能有效抑制MC38细胞集落形成。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验显示，与单独的c-di-AMP二铵或Zn/Mn-MOF相比，AMP@Zn/Mn-MOF对MC38细胞、人结肠癌细胞LOVO和DLD-1均表现出更强的细胞毒性，且呈剂量依赖性，而对非肿瘤细胞系（小鼠脑源性内皮细胞BEND.3）的细胞毒性较低，显示出其广谱细胞毒性和强大的抗癌活性。
2.3 pH响应性释放特性
在酸性水环境中（pH 4.5），24小时内约有89.4%的c-di-AMP二铵从AMP@Zn/Mn-MOF中释放。在pH 5.5和6.5条件下，释放率分别降至50.6%和27.1%。Mn和Zn离子的释放也呈现pH依赖性。ICP–MS分析显示，在pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液中孵育24小时后，AMP@Zn/Mn-MOF释放了65.7%的Mn离子和86.8%的Zn离子。而在中性缓冲液（pH 7.5）中，仅释放了14.5%的Mn离子和16.2%的Zn离子。在10 mM谷胱甘肽（GSH）和pH 4.5的条件下，24小时内Mn和Zn离子的释放率分别超过91.3%和97.6%，c-di-AMP二铵的释放率达到99.8%。这些结果表明AMP@Zn/Mn-MOF具有pH/GSH双响应性，有助于其在肿瘤治疗中的应用。
2.4 催化活性
鉴于Mn2+能催化类芬顿反应，评估了AMP@Zn/Mn-MOF的过氧化物酶（POD）模拟催化活性。以H2O2为底物，亚甲蓝（MB）为指示剂，检测羟基自由基（•OH）的生成。在中性条件（pH 7.5）下，AMP@Zn/Mn-MOF产生少量•OH；而在酸性条件（pH 4.5）下，•OH产量逐渐增加。GSH的加入进一步增强了•OH的产生，表明pH/GSH双响应能协同提高类芬顿反应效率。电子顺磁共振（EPR）使用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为自旋捕获剂，证实了AMP@Zn/Mn-MOF组产生最强的•OH信号。
肿瘤组织中高水平的GSH会在催化过程中消耗ROS。采用5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）作为探针，评估了AMP@Zn/Mn-MOF的GSH消耗能力。紫外-可见光谱分析显示，随着酸化程度增加，DTNB在410 nm处的吸收峰显著降低，表明AMP@Zn/Mn-MOF的GSH耗竭能力具有高度pH依赖性。这些结果表明AMP@Zn/Mn-MOF能催化转化内源性H2O2，产生ROS风暴用于肿瘤治疗。
在肿瘤细胞中，使用ThiolTracker探针染色检测细胞内GSH水平，发现AMP@Zn/Mn-MOF处理能显著降低MC38细胞内的GSH水平，与溶液实验结果一致。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为荧光探针测量细胞内ROS水平，CLSM图像显示AMP@Zn/Mn-MOF处理组的绿色荧光强度最强，表明其能有效产生ROS并引发细胞内氧化应激。ROS的积累导致严重的脂质过氧化和线粒体去极化。使用MitoPeDPP检测线粒体内ROS的产生，AMP@Zn/Mn-MOF组显示出最强的荧光强度，证实其能诱导明显的氧化损伤。生物透射电子显微镜（Bio-TEM）观察显示，与正常线粒体形态相比，AMP@Zn/Mn-MOF处理后出现典型的线粒体功能障碍特征。综上，AMP@Zn/Mn-MOF同时具备ROS生成和GSH耗竭能力，可诱导肿瘤细胞死亡。
2.5 AMP@Zn/Mn-MOF刺激cGAS-STING通路激活
近期研究表明，Zn2+、Mn2+或c-di-AMP二铵能有效激活cGAS-STING通路。通过蛋白质印迹法（Western Blot）探讨了AMP@Zn/Mn-MOF对肿瘤细胞cGAS-STING通路的激活作用。结果显示，AMP@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞中磷酸化STING（p-STING）、磷酸化TBK1（p-TBK1）和磷酸化IRF3（p-IRF3）的水平最高，表明cGAS-STING通路被强烈激活。而感知胞质dsDNA片段以激活STING的cGAS表达水平几乎不变。CLSM分析进一步显示，AMP@Zn/Mn-MOF处理后，p-TBK1和p-IRF3的荧光强度显著强于c-di-AMP二铵或Zn/Mn-MOF单独处理组。此外，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测发现，AMP@Zn/Mn-MOF组中cGAS-STING通路的关键效应因子IFN-β的mRNA表达水平显著升高。STING也能通过NF-κB通路在巨噬细胞中触发促炎反应，但在AMP@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞中，磷酸化NF-κB（p-NF-κB）的表达未受影响。为排除由cGAMP激活cGAS-STING通路的可能性，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了纳米颗粒触发的内源性cGAMP水平，发现AMP@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞内cGAMP水平与对照组相比几乎无变化。这些结果证明AMP@Zn/Mn-MOF能有效激活cGAS-STING通路并刺激免疫反应。
2.6 AMP@Zn/Mn-MOF诱导免疫原性细胞死亡（ICD）
在本设计中，AMP@Zn/Mn-MOF能有效诱导细胞死亡并激活cGAS-STING信号通路，从而触发ICD。在ICD过程中，细胞膜破裂导致三磷酸腺苷（ATP）、高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）和乳酸脱氢酶（LDH）释放，同时钙网蛋白（CRT）易位至细胞膜表面。与对照组相比，AMP@Zn/Mn-MOF处理组细胞内ATP水平显著降低，而释放的LDH水平更高，表明AMP@Zn/Mn-MOF显著破坏了细胞膜完整性。相应地，AMP@Zn/Mn-MOF处理后细胞核内HMGB-1的荧光强度显著降低。与PBS组相比，AMP@Zn/Mn-MOF组的CRT荧光强度显著增加，进一步支持了ICD的发生。
为证实AMP@Zn/Mn-MOF诱导的ICD的免疫原性，研究了小鼠巨噬细胞（RAW264.7）的免疫反应。流式细胞术分析显示，与AMP@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞上清液共孵育后，CD86+巨噬细胞的比例逐渐增加。在骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中也观察到类似趋势，AMP@Zn/Mn-MOF处理增加了CD86的表达，表明ICD的激活促进了巨噬细胞极化以实现免疫激活。与巨噬细胞类似，AMP@Zn/Mn-MOF处理能显著增强DC2.4细胞的成熟能力。此外，暴露于AMP@Zn/Mn-MOF处理的MC38细胞上清液能显著增强巨噬细胞迁移，证实AMP@Zn/Mn-MOF能 dramatically提高MC38细胞的免疫原性。这些结果表明，AMP@Zn/Mn-MOF联合激活ICD和cGAS-STING通路能有效增强免疫反应。
2.7 AMP@Zn/Mn-MOF的体内抗肿瘤效果
基于AMP@Zn/Mn-MOF优异的cGAS-STING通路激活能力和癌细胞杀伤能力，在侵袭性强且免疫原性弱的MC38肿瘤模型小鼠中评估了其治疗效果。通过静脉注射FITC标记的Zn/Mn-MOF（FITC@Zn/Mn-MOF）到MC38荷瘤小鼠体内，系统评估了纳米颗粒的生物分布。活体成像系统（IVIS）结果显示，注射后24小时，FITC@Zn/Mn-MOF在肿瘤部位大量积聚，证实了其有效的肿瘤靶向能力。离体生物分布图像显示FITC@Zn/Mn-MOF主要积聚在肿瘤组织，在肺和肝脏中检测到的荧光信号很少。肿瘤切片的免疫荧光染色和从经FITC@Zn/Mn-MOF处理的小鼠切除的肿瘤的ICP–MS分析进一步证实了其优异的肿瘤靶向能力。
已有研究表明，cGAS-STING信号在某些情境下会上调PD-L1表达。而αPD-L1抗体通过抑制肿瘤细胞上的PD-L1与细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）上的PD-1之间的相互作用来增强抗肿瘤免疫反应。随后研究发现AMP@Zn/Mn-MOF不影响MC38细胞中PD-L1的表达，突出了肿瘤异质性。
为评估AMP@Zn/Mn-MOF的抗肿瘤效果，建立了MC38荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将小鼠随机分为六组（每组n=5）：(G1) PBS、(G2) c-di-AMP二铵、(G3) Zn/Mn-MOF、(G4) AMP@Zn/Mn-MOF、(G5) αPD-L1、(G6) AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1。在MC38肿瘤接种后第8天，小鼠接受静脉注射AMP@Zn/Mn-MOF和腹腔注射αPD-L1抗体。为确保治疗效果，在第11天和第14天重复治疗。监测小鼠体重和肿瘤体积。与PBS组相比，c-di-AMP二铵和αPD-L1单药治疗组的肿瘤生长未受到显著抑制，证实MC38肿瘤对单独的免疫佐剂不敏感。AMP@Zn/Mn-MOF组观察到的轻度肿瘤抑制归因于其细胞毒性作用。值得注意的是，AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1联合治疗组的肿瘤生长被显著抑制，表明AMP@Zn/Mn-MOF诱导的ICD增强了αPD-L1抗体的治疗活性。治疗结束时，切除肿瘤并称重以验证抑瘤效果。肿瘤的重量和照片与肿瘤体积的变化相关。此外，AMP@Zn/Mn-MOF与αPD-L1的联合治疗实现了超过89%的抑瘤率，超过了单独的AMP@Zn/Mn-MOF（70%）、c-di-AMP二铵（14%）或αPD-L1（18%）。
随后，对各亚组的肿瘤组织进行组织学分析，包括Ki67免疫组织化学（IHC）染色和苏木精-伊红（H&E）染色。与其他组相比，AMP@Zn/Mn-MOF和αPD-L1联合治疗组表现出明显的组织损伤、核碎裂和核溶解。相应地，AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组中Ki67阳性细胞的百分比明显下降，进一步表明联合治疗具有最强的抑制肿瘤增殖能力。接下来，探讨了AMP@Zn/Mn-MOF的催化活性是否在肿瘤组织中发生以增强联合治疗的抗肿瘤效果。CLSM结果显示，AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1治疗组的ROS水平最高，GSH水平最低，而AMP@Zn/Mn-MOF组观察到中等水平的ROS和GSH，表明ICD被激活。总之，这些结果表明，AMP@Zn/Mn-MOF激活ICD能有效增强αPD-L1抗体的体内抗肿瘤效果。
2.8 抗肿瘤效果的RNA-seq分析
对MC38肿瘤组织进行RNA测序（RNA-seq），以探索潜在的治疗机制。火山图显示，PBS组与AMP@Zn/Mn-MOF组之间有998个基因表达存在差异，包括488个上调基因和510个下调基因。基因本体论（GO）富集分析表明，多个生物过程被激活，包括“钙离子结合”、“锌离子螯合活性”、“嗜酸性粒细胞迁移的正向调控”和“CCR3趋化因子受体结合”，表明AMP@Zn/Mn-MOF有助于抗肿瘤免疫。为进一步阐明cGAS-STING激活的机制，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，经AMP@Zn/Mn-MOF治疗的肿瘤激活了几条关键通路，如“病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用”、“趋化因子信号通路”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”和“单纯疱疹病毒1型感染”。如前所述，cGAS-STING通路在调节抗病毒和炎症免疫反应中起关键作用。与既往研究一致，“趋化因子信号通路”和“单纯疱疹病毒1型感染”的激活进一步证实了AMP@Zn/Mn-MOF治疗的肿瘤中cGAS-STING通路的激活。此外，一些与细胞周期相关的基因，如细胞周期蛋白D3（Ccnd3）、CDC14细胞分裂周期14A（Cdc14a）、细胞周期进程1（Ccpg1）、RB转录辅抑制因子1（Rb1）和RB转录辅抑制因子样2（Rbl2），在AMP@Zn/Mn-MOF治疗的肿瘤中显著下调，进一步证明AMP@Zn/Mn-MOF治疗能有效抑制肿瘤细胞增殖。
促炎细胞因子在激活、动员和增强免疫细胞活性，从而加强抗肿瘤免疫反应方面起着至关重要的作用。为评估AMP@Zn/Mn-MOF对此过程的影响，采用ELISA检测了体内与cGAS-STING通路激活相关的关键促炎细胞因子水平。AMP@Zn/Mn-MOF治疗导致血清中TNF-α、IL-6和IFN-β的浓度显著升高，显著高于PBS治疗组。此外，与增强免疫反应相关的几个基因的mRNA表达水平，如Ccl24（C-C基序趋化因子配体24）、Il1b（白细胞介素1β）、Irak2（白细胞介素-1受体相关激酶2）、Il11ra1（白细胞介素11受体亚基α1）、Tnfaip2（肿瘤坏死因子α诱导蛋白2）、Traf3（TNF受体相关因子3）和Ly6e（淋巴细胞抗原6家族成员E），在AMP@Zn/Mn-MOF治疗的肿瘤中显著升高。这些发现共同证实，AMP@Zn/Mn-MOF有效激活了cGAS–STING通路，从而引发了强大的系统性抗肿瘤免疫反应。
2.9 AMP@Zn/Mn-MOF NPs与αPD-L1联合免疫疗法重塑免疫抑制性TME
证实AMP@Zn/Mn-MOF与αPD-L1联用可增强抗肿瘤免疫效果。随后通过流式细胞术评估肿瘤浸润淋巴细胞。在治疗期结束时从MC38荷瘤小鼠收集新鲜肿瘤组织。在AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组，肿瘤微环境（TME）中成熟树突状细胞（DCs）的比例从2.59%显著增加至7.11%，表明ICD和cGAS-STING通路的激活促进了DC浸润，增强了抗原呈递和免疫系统激活，这有助于随后向T细胞呈递抗原以启动适应性免疫反应。肿瘤浸润的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对抗肿瘤免疫至关重要。经AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1治疗后，CD8+CTLs的百分比达到41.3%，显著高于对照组（30.7%）。在没有αPD-L1的情况下，单独的AMP@Zn/Mn-MOF仅适度增加了CTL浸润（36.8%）。此外，在AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组，免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）的浸润从17.0%减少到8.2%，这可能是ICD和cGAS-STING通路激活联合作用的结果。自然杀伤（NK）细胞是另一种细胞毒性淋巴细胞，其在AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组中的比例也显著升高。肿瘤组织的免疫荧光染色显示，AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组中CD8+CTLs的数量显著增多，印证了流式细胞术分析的结果。总之，这些结果表明AMP@Zn/Mn-MOF与αPD-L1联用增强了CTL浸润，并有效重编程了免疫抑制性TME。
2.10 联合疗法诱导系统性抗肿瘤反应以抑制远端肿瘤
观察到的免疫激活促使我们探索远隔效应对远端肿瘤的影响。值得注意的是，在右侧初次肿瘤接种4天后，将MC38细胞皮下植入小鼠左侧。植入后三天，将小鼠随机分为四组（每组n=5）：(G1) PBS、(G2) AMP@Zn/Mn-MOF、(G3) αPD-L1、(G4) AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1。有趣的是，αPD-L1单药治疗对远端肿瘤的生长抑制没有显著影响，而单独的AMP@Zn/Mn-MOF导致适度的肿瘤生长抑制。相比之下，AMP@Zn/Mn-MOF与αPD-L1联用显著延缓了肿瘤生长。与其他组相比，AMP@Zn/Mn-MOF+αPD-L1组远端肿瘤的重量和抑制率显著更高，突出了通过cGAS-STING通路激活和I
