《Journal of Hazardous Materials》：Label-free Non-destructive Spectroscopic Detection of Mixed Microplastic Uptake and Differential Effects on Intestinal Epithelial Cells
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本研究利用O-PTIR光谱技术检测并鉴定肠道上皮细胞摄入的真实世界微塑料，揭示其引发的氧化应激和代谢紊乱，证实O-PTIR在非破坏性、高分辨率微塑料分析中的有效性。
夏洛特·E·索菲尔德（Charlotte E. Sofield）| 爱德华·阿滕伯勒（Edward Attenborough）| 瑞安·S·安德顿（Ryan S. Anderton）| 阿纳斯塔扎娅·M·戈雷茨基（Anastazja M. Gorecki）| 刘珊秋（Li Shan Chiu）| 奇多齐·C·阿尼亚埃布（Chidozie C. Anyaegbu）| 卡米拉·科昌（Kamila Kochan）
澳大利亚圣母大学健康科学学院，弗里曼特尔，西澳大利亚州，澳大利亚
摘要
由于长期暴露以及新兴的细胞影响证据，微塑料是一种对人类健康构成重大威胁的环境和饮食污染物。然而，由于在生物样本中检测和识别微塑料的挑战，人们对这种影响的理解仍然有限。本研究旨在使用光热红外光谱（O-PTIR）技术来检测和表征被肠道细胞内化的实际微塑料，并探究这种暴露对细胞的影响。将一种肠道上皮细胞系（IEC-6）暴露于物理降解的荧光微塑料（浓度为25-100 μg/mL）中，这些微塑料由四种聚合物制成，暴露时间为24小时。首先获取了单种着色塑料的O-PTIR参考光谱，随后利用荧光引导的O-PTIR技术来识别和表征IEC-6细胞中的微塑料。我们确定在这些条件下的分辨率极限约为1 μm。仅通过O-PTIR数据就成功检测并区分了所有类型聚合物的微塑料。重要的是，通过对细胞质O-PTIR光谱进行主成分分析，发现了微塑料引起的代谢变化。这种化学计量分析表明，微塑料暴露会导致氧化应激和代谢紊乱，表现为蛋白质构象变化——包括早期错误折叠和聚集的迹象，这些都是细胞应激适应反应的典型特征。我们的发现表明，O-PTIR是一种高效、无损的技术，适用于生物样本中的微塑料研究，能够实现微塑料的识别、定位和表征，同时揭示它们对细胞功能和组成的影响。
引言
自20世纪40年代塑料工业化以来，全球塑料产量呈指数级增长，但塑料回收速度未能跟上生产步伐。据估计，2020年全球只有9.54%的塑料废物得到了回收，其余的被填埋（48.72%）、焚烧（19.57%）、管理不善（12.90%）或成为垃圾（0.3%）[1]。塑料的大规模生产、使用和处置导致了广泛的环境微塑料污染。微塑料是直径小于1毫米的塑料颗粒，当初级塑料在紫外线、化学物质、热量、油和机械力的作用下降解时会产生[2]。令人担忧的是，微塑料是食物和饮用水中普遍存在的污染物；它们主要来源于受污染的水体和塑料食品包装[3]、[4]。因此，口服微塑料是人类长期暴露的一个令人担忧的途径，越来越多的研究证实微塑料会被胃肠道吸收并在体内积累[5]。
在生态材料和生物组织中识别微塑料一直是一个困难且存在争议的问题。常用的检测方法包括热解气相色谱[6]、傅里叶变换红外（FTIR）光谱[7]和拉曼光谱[8]。这些方法在化学鉴定之前不需要对样本进行分类或计数，因此比尼罗红染色等手动技术更准确可靠。与热解气相色谱不同，FTIR和拉曼技术是非破坏性的，可以保留空间信息。然而，这些方法的分辨率较低（5.5-30 μm），并且分别受到水合作用和荧光干扰[9]。原子力显微镜红外（AFM-IR）是一种更现代的红外技术，可以实现纳米级分辨率，并且适用于荧光样本[9]。然而，AFM-IR需要样本与悬臂梁之间的物理接触，这可能会损坏脆弱的样本，并且数据采集和分析耗时较长[10]。
这些传统技术的局限性在很大程度上被新兴的光热红外（O-PTIR）光谱技术所克服。这种非接触式、无损且无需标记的技术具有高分辨率（<500 nm），并且作为一种基于红外的技术，不受荧光影响，非常适合用于临床和临床前样本中的微塑料识别。O-PTIR已应用于多种生物学领域，从真核细胞特性分析[11]和蛋白质错误折叠[12]到细菌聚合物合成[13]。该技术利用中红外量子激光级联效应诱导样本局部热膨胀，从而降低局部折射率。这种光热效应通过光学探针束检测到，生成的吸收光谱独特地反映了样本的化学组成[9]。可以通过与常见聚合物吸收光谱中的显著或独特峰相关的目标波长来识别和化学区分微塑料。尽管有少数研究使用O-PTIR识别了聚苯乙烯（PS）[14]、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚乙烯[15]和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）[预印本；[16]以及细胞和组织中的微球，但这些研究中使用的商业聚合物微球缺乏环境和生物学相关性。
现有的微塑料检测方法大多具有破坏性，或者分辨率不足，或者与生物材料的兼容性不佳。建议整合能够保持生物样本完整性的检测方法，以增进我们对微塑料生物可利用性和影响的理解。为了解决这一难题，本研究使用O-PTIR技术在生物组织中识别和区分四种不同聚合物的微塑料。为了提高研究的现实相关性，我们将由家用物品制成的实际微塑料（包括PET、聚四氟乙烯（PTFE）、PS和聚氯乙烯（PVC）暴露于体外肠道上皮模型中。这些实际微塑料可以通过紫外线老化[17]、热降解[18]或物理降解方法（如冷冻研磨[19]或磨损[20]、[21]）人工生成，本研究也采用了这些方法。我们的平台结合了O-PTIR和荧光技术，利用荧光引导的振动光谱来识别和化学表征微塑料。本研究使用了一种热激活的合成织物染料来诱导微塑料荧光（而不是像尼罗红这样的亲脂性染料），因为这种染料价格便宜、稳定，并且根据我们的数据和其他已发表的研究[22]、[23]，在不同聚合物上都能产生稳定的荧光。
我们成功地利用O-PTIR数据在生物基质中识别了混合聚合物的微塑料，表明这种技术具有在临床和环境样本中应用的潜力。我们还证明了实际微塑料被IEC-6细胞内化，这通过细胞质O-PTIR光谱的高级化学计量分析显示出了明显的生化功能障碍。重要的是，我们强调了O-PTIR在生物样本中检测微塑料的关键优势和局限性，这将为未来研究生物系统中的微塑料污染提供有用的指导。
实验部分
实际微塑料的制备
PET碎片来自透明水瓶，其他初级塑料从澳大利亚的一家五金店购买：PTFE（不粘烤盘衬里）、PS（垫圈）和PVC薄膜（保鲜膜）。这些初级塑料用合成织物染料染色，使其在远红波长下发出荧光。将塑料与预先加热的Jacquard iDye Poly blue（JID3451，浓度为12.5 mg/mL）混合后，在70°C的干燥箱中孵育3小时。冷却后，
结果与讨论
本研究的主要目的是使用O-PTIR技术识别肠道上皮细胞内的物理降解微塑料。首先，通过维度共聚焦显微镜观察了微塑料与细胞的粘附和摄取情况。然后，我们展示了基于特征红外光谱可以在亚细胞分辨率下区分细胞物质和聚合物。重要的是，O-PTIR能够区分四种不同聚合物（PET、PTFE、PS和PVC）共存的微塑料
结论
本研究在新的背景下使用O-PTIR技术，化学识别并区分了肠道上皮细胞单层中的四种不同聚合物的实际微塑料，并评估了它们的代谢效应。通过共聚焦显微镜和O-PTIR技术的结合，我们证明了这些具有环境相关性的异质微塑料能够附着并被IEC-6细胞内化，从而提供了细胞摄取的直接证据。重要的是，O-PTIR技术实现了微塑料的同时分析
环境相关性声明
这项研究展示了光热红外（O-PTIR）光谱技术作为检测生物和环境样本中微塑料的一种新兴方法。微塑料是一种危险的环境污染物，因为它们无处不在且具有潜在的生物毒性。与以往的研究相比，本研究使用了由家用聚合物制成的不规则微塑料，而非聚苯乙烯微球，从而提高了研究的现实相关性和生物学意义。
资金来源
本研究是在CES作为澳大利亚政府研究培训计划奖学金获得者期间在澳大利亚圣母大学进行的。
CRediT作者贡献声明
奇多齐·阿尼亚埃布（Chidozie Anyaegbu）：写作 – 审稿与编辑、监督、资源提供。阿纳斯塔扎娅·戈雷茨基（Anastazja Gorecki）：写作 – 审稿与编辑、监督、资源提供。瑞安·安德顿（Ryan Anderton）：写作 – 审稿与编辑、监督、资源提供、项目管理、方法论、资金筹集。爱德华·阿滕伯勒（Edward Attenborough）：写作 – 审稿与编辑、可视化、软件使用、资源提供、项目管理、方法论、研究设计、数据分析、概念化。卡米拉·科昌（Kamila Kochan）：写作 – 审稿与编辑，利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
