电活性刺激与机械转导抑制的结合可促进神经再生

《Materials Today》：Electroactive stimulation coupled with mechanotransduction inhibition enhance neuroregeneration

本研究发现持续激活的FAK-YAP信号通路抑制神经元分化，反而促进成骨和血管生成。通过抑制YAP核转位并增强β-catenin降解，维持带电基质诱导的神经分化。动物实验证实联合抑制FAK-YAP信号轴与带电基质可协同促进坐骨神经再生及功能恢复，为精准调控干细胞分化提供新策略。

　　

李晓婵|洪文钦|于华杰|穆媛|白云阳|吴珂|邓旭亮|张学辉

北京大学口腔医学院与医院牙科材料与牙科医疗器械检测中心，中国北京

摘要

引导神经元分化对于促进神经再生至关重要。然而，成体干细胞的相对较低的神经发生潜力构成了一个严峻的挑战。在本研究中，我们发现通过带电基底持续激活FAK-YAP机械转导信号通路并不利于人类脱落乳牙（SHED）干细胞的神经元分化，反而促进了不同谱系的分化。使用特定的小分子抑制剂抑制YAP向细胞核的转移可以防止骨形成和血管生成等不同谱系的分化。这是通过增加细胞质中p-YAP与β-连环蛋白降解复合物的结合来实现的，从而通过增强β-连环蛋白的降解来维持和提高带电基底诱导的神经元分化效率。通过在大鼠坐骨神经损伤模型中植入带有带电基底和YAP抑制剂的SHED，临床前评估显示神经再生显著增强，坐骨神经功能也得到了改善。因此，我们的研究提出了一种抑制FAK-YAP信号通路作为促进带电基底诱导的神经再生的协同治疗策略。

引言

急性创伤引起的神经损伤可能导致运动功能丧失、肌肉麻痹甚至终生残疾[1]、[2]、[3]。由于神经组织的自我修复能力有限[2]，神经再生一直是临床治疗中的一个棘手问题。诱导来自非神经组织/器官的成体干细胞谱系的神经元分化被认为是一种有前景的策略[3]。间充质干细胞（MSCs）不仅可以分化为神经元细胞，还表现出强烈的旁分泌功能，能够协同促进神经再生[4]、[5]。其中，人类脱落乳牙（SHED）的干细胞由于其胚胎神经嵴起源和广泛的增殖能力而具有较高的神经元分化潜力[6]，这使它们成为神经再生治疗的理想细胞来源[7]。多能SHED表现出高度的可塑性，能够分化为中枢和周围神经系统的各种神经元谱系[6]、[7]、[8]、[9]。大量的SHED可以从儿童脱落的乳牙中轻易获得，可以作为自体免疫兼容的成体干细胞来源用于未来的治疗。然而，由于SHED的高度可塑性和多谱系分化潜力，精确调控神经元谱系的分化是一个主要挑战。

为了提高基于干细胞的神经再生疗法的效果，研究人员采用了多种策略，如使用带有电刺激的支架[10]、[11]和促神经发生因子治疗[12]，并开发了多种促神经再生的生物材料[13]、[14]。我们发现带电纳米复合膜可以诱导SHED的神经元分化，但无法维持神经发生。这可能是因为带电基底常常会诱导成体干细胞分化为多种非神经元谱系[15]、[16]。到目前为止，神经再生诱导策略尚未完全克服干细胞分化中的异质性问题。因此，仍需要进一步开发更有效的基于干细胞的神经再生生物工程策略[17]。特别是，确定指导干细胞特异性神经元分化的关键分子信号靶点，同时防止其向多个谱系分化是当务之急。

特别值得关注的是FAK-YAP机械转导信号通路，因为我们的先前研究[19]表明，带电基底可以通过促进 focal adhesions 的聚集和增加细胞骨架元素内的机械应力来激活该通路。此前，Fan等人[20]报告称，电刺激最初激活的YAP1信号可以触发海马神经干细胞（NSCs）的神经元分化，但重组过表达YAP1并未诱导神经元分化。研究发现，电刺激引起的长期YAP1信号会抑制SHED的长期神经发生。在这里，我们报告说抑制FAK-YAP信号可以维持和增强带电基底诱导的SHED神经元谱系分化。其潜在机制涉及细胞质中p-YAP的积累，这通过稳定β-连环蛋白的降解复合物来促进其降解。为了验证FAK-YAP信号轴作为治疗靶点的有效性，我们通过在大鼠坐骨神经损伤模型中植入带有带电基底和YAP抑制剂Verteporfin，证明了神经再生和神经功能恢复的协同促进作用。因此，我们的研究提出了一种通过电刺激和YAP抑制来协调SHED神经元谱系分化的策略。

章节摘录

FAK-YAP机械转导信号通路被带电基底激活，从而启动神经元分化

基于我们之前的研究[21]，将铁电颗粒纳米钛酸盐均匀分散到P(VDF-TrFE)中，制备出柔性的铁电BaTiO₃/P(VDF-TrFE)膜作为带电基底。随后，通过电晕极化，我们获得了具有带电表面的纳米复合膜，这些膜可以在没有外部电源的情况下提供连续的电刺激。在整个8 W的持续时间内，zeta电位和d₃₃值保持相对稳定，表明

抑制FAK-YAP机械转导信号通路通过促进β-连环蛋白降解来增强成体干细胞的神经发生

为了阐明抑制FAK-YAP机械转导信号通路如何增强带电基底诱导的成体干细胞神经发生，我们使用了下游抑制剂Verteporfin。KEGG信号通路富集分析（图3A）列出了在带电基底上培养8天的SHED中上调的前15个信号通路（在Verteporfin存在下与未经处理的对照组相比）。其中一些上调的信号通路起着关键作用

将带电基底与SHED和FAK-YAP抑制剂联合植入可促进大鼠坐骨神经损伤模型中的神经再生和神经功能恢复

选择大鼠的5毫米坐骨神经缺损模型来评估Verteporfin在促进带电基底诱导的SHED神经发生方面的体内效果。可以观察到，在8 W的时间内，Verteporfin主要处于释放状态，这是由于药物负载的GelMA在体外释放所致（图S9E）。总共有五个组（图4A）：（1）假手术组，（2）用丝线缝合神经断端，然后将带电基底包裹在神经损伤部位（阴性

讨论

本研究的结果明确表明，抑制FAK-YAP机械转导信号通路可以增强带电基底诱导的成体干细胞神经发生。电刺激和机械转导信号在FAK激酶和focal adhesion（FA）形成的水平上相互耦合，导致电刺激对神经元分化产生拮抗作用。一方面，电刺激可以促进早期神经元分化

结论

因此，本研究确定了一个有前景的治疗靶点，用于增强基于成体干细胞的神经再生，从根本上克服了干细胞分化的异质性，从而在原位实现更精确的神经元谱系调控。这有望为开发基于已识别调控靶点的新型生物材料以促进神经再生提供有用的线索。本研究的一个主要局限性是我们主要关注了细胞质机制

资助与致谢

我们感谢北京Tason Biotech有限公司（https://www.kqgxbk.com，中国北京）为我们的研究提供SHED。本研究得到了中国国家自然科学基金82221003（资助X.D.）、中国国家重点研发计划2021YFB3800800（资助X.Z.）、中国国家自然科学基金52273258（资助X.Z.）、82221003（资助X.D.）、U22A20160（资助X.D.）、32200658（资助Y.B.）和82501240（资助X.L.）以及北京市科技局的支持

作者贡献

X.L、B.C.H和H.Y完成了大部分实验。X.L、B.C.H和X.Z撰写了手稿。X.L进行了RNA-Seq和ATAC-Seq数据分析。M.Y和K.W进行了动物实验。B.C.H进行了qRT-PCR实验和分析。X.L、H.Y、Y.B和K.W协助进行了生物信息学分析。X.Z和X.D设计并解释了所有实验。

CRediT作者贡献声明

李晓婵：撰写——初稿。洪文钦：撰写——初稿。于华杰：撰写——初稿。穆媛：方法学。白云阳：方法学。吴珂：数据管理。邓旭亮：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。张学辉：撰写——审阅与编辑、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。