一种无需亚硝酸盐、在低温条件下对肉类进行多酶级联染色的方法：由NOS-YkuN-YumC和葡萄糖脱氢酶催化实现

《Meat Science》：Multi-enzyme cascade colouring for meat without nitrite at low-temperature: Catalysis by NOS-YkuN-YumC and glucose dehydrogenase

本研究构建了重组枯草芽孢杆菌表达系统，高效表达并纯化葡萄糖脱氢酶（GDH），通过GDH补充NADPH增强NOS-YkuN-YumC融合酶在低温（10℃）下催化生成硝基肌红蛋白，显著提升肉制品的a*值（红度），且烹饪后颜色保持稳定，为无硝酸盐肉制品开发提供了新策略。

　　

肖青|周亚莉|罗慧婷|陈丛贵|徐宝才|李培军

合肥工业大学食品衍生功能因子与合成生物学联合研究中心，中国合肥230601

摘要

本研究探讨了多酶级联系统在10°C条件下对肉制品着色作用的影响。该系统由葡萄糖脱氢酶（GDH）和融合酶NOS-YkuN-YumC组成，后者是通过将NOS基因与黄酮结合蛋白YkuN和黄酮还原酶YumC的编码基因进行基因融合获得的。结果表明，重组GDH成功地在枯草芽孢杆菌 168中表达并纯化。纯化的GDH分子量约为32 kDa，比活性为11.40 U/mg，显示出较高的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生效率。在10°C下孵育24小时后，添加GDH显著提高了（P < 0.05）绞肉的< />，而与仅使用NOS-YkuN-YumC处理的组相比没有显著差异（P > 0.05）。紫外-可见光谱进一步证明，GDH的加入有效促进了亚硝基肌红蛋白（NO-Mb）的形成。烹饪后，添加GDH的绞肉比仅使用NOS-YkuN-YumC处理的绞肉具有更高的< />。这些结果表明，GDH的添加促进了NADPH的生成，从而增强了NOS-YkuN-YumC催化生成NO的能力，进而改善了生肉中的NO-Mb形成和< />，并且这种着色效果在烹饪后的肉中也能保持稳定。这项概念验证研究成功展示了该多酶级联系统在低温条件下用于无亚硝酸盐肉制品着色的潜力。

引言

颜色是肉制品的关键感官属性，直接影响消费者的视觉感知。众所周知，亚硝酸盐通过转化为亚硝酸和一氧化氮（NO）在腌肉着色过程中起着关键作用（Parthasarathy & Bryan, 2012）。NO随后与肌红蛋白（Mb）结合生成亚硝基肌红蛋白（NO-Mb），这是腌肉独特红色的关键色素（Tomasevic, Djekic, Font-i-Furnols, Terjung, & Lorenzo, 2021）。然而，肉制品中的亚硝酸盐存在潜在的健康风险，因为它会与仲胺反应生成致癌的N-亚硝胺（Deveci & Tek, 2024; Sindelar & Milkowski, 2012; Liu et al., 2017）。根据国际癌症研究机构的分类，N-亚硝胺被归类为2A类致癌物（IARC, 1978）。因此，寻找替代亚硝酸盐的着色剂对于腌肉生产至关重要。

细菌一氧化氮合成酶（NOS）近年来已成为亚硝酸盐的有希望的替代品，吸引了大量研究关注（Huang, Luo, Chen, Li, & Xu, 2024; Ras, Leroy, & Talon, 2018）。NOS的功能是催化L-精氨酸的氧化，生成NO，这是NO-Mb形成的直接前体（G?tterup et al., 2008; Mansuy & Boucher, 2004）。NOS基因（nos）已在多种微生物中鉴定出来，如枯草芽孢杆菌和木糖葡萄球菌（Patel & Crane, 2010; Ras et al., 2018; Ras, Leroy, & Talon, 2018）。我们之前的研究表明，添加纯化NOS的肉比含有亚硝酸盐的肉具有更低的< />（Huang et al., 2020; Huang et al., 2020; Li, Luo, Zhou, Xu, & Li, 2024; Li, Chu, & Ban, 2024）。为了提高着色效率，我们通过将NOS基因与黄酮结合蛋白YkuN和黄酮还原酶YumC的编码基因进行基因融合，开发了一种名为NOS-YkuN-YumC的融合酶。研究发现，在25°C下孵育24小时后，使用NOS-YkuN-YumC处理的肉具有与亚硝酸盐相似的着色效果（Zhou, Luo, Chen, Xu, & Li, 2025）。尽管NOS-YkuN-YumC在改善肉色方面表现出很大潜力，但在广泛应用之前仍需解决一些问题。研究表明，酶活性受辅因子、温度和底物浓度的影响，这些因素会改变肉制品的着色过程（Ghosh, Somasundar, & Sen, 2021; Mansuy & Boucher, 2004; Mittal & Kakkar, 2020）。我们的初步研究还发现，辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是NOS-YkuN-YumC催化着色过程的关键调节因子（Zhou, Luo, et al., 2025）。然而，研究发现屠宰后猪肉中的NADPH含量迅速下降，直接影响肉色（Zhou, Luo, et al., 2025）。此外，酶活性在低温条件下也会受到抑制（Brannan & Decker, 2002），例如10°C，这是肉类加工和储存中常见的温度（Kang, Gao, Ge, Zhou, & Zhang, 2017; Kim & Chin, 2021; Nielsen, 1983）。与此一致，我们的初步研究发现，NOS-YkuN-YumC在10°C下的活性明显低于25°C。因此，达到相似的着色效果所需的时间大约是25°C下的两倍（Zhou, Luo, et al., 2025）。这些因素限制了融合酶在肉类加工中的应用。基于这些发现，保持稳定的NADPH供应对于在低温条件下通过NOS-YkuN-YumC实现有效着色至关重要。然而，直接补充NADPH由于其高成本和不稳定而不适合实际使用（Cross, 2023; Xu et al., 2020）。因此，开发一个NADPH再生系统对于肉制品的酶法着色至关重要。

在众多NADPH再生酶中，葡萄糖脱氢酶（GDH）因其高酶活性和稳定性而成为首选（Liao et al., 2021）。GDH可以催化β-D-葡萄糖和NADP⁺生成D-葡萄糖内酯和NADPH（Li et al., 2023）。研究发现，GDH广泛存在于枯草芽孢杆菌等细菌中（Boontim, Yoshimune, Lumyong, & Moriguchi, 2006; Xu et al., 2025）。然而，野生型菌株的工业应用潜力受到其较低GDH产量的限制。重组表达技术已成为提高GDH表达水平的关键策略（Montgomery, Dupont, Leivo, & Guillemette, 2010）。由于枯草芽孢杆菌被美国食品药品监督管理局认定为GRAS微生物，它在工业蛋白质合成中具有明显优势（Kumari et al., 2023）。因此，从枯草芽孢杆菌表达系统中获得高活性的GDH，并构建用于低温加工的NOS-YkuN-YumC多酶级联系统具有重要意义，但目前尚未有相关研究。

本研究构建了一个重组表达系统，以实现枯草芽孢杆菌中的高效GDH表达。随后，在低温条件下评估了由NOS-YkuN-YumC和GDH组成的多酶级联系统的着色潜力。我们假设该多酶级联系统能够在不添加亚硝酸盐的情况下，在低温加工过程中为肉制品提供所需的颜色。

部分内容

微生物和生长条件

表1列出了本研究中使用的微生物菌株和质粒。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌在37°C下使用Luria Bertan（LB）肉汤或在LB琼脂平板上培养（Huankai Microbial Technology Co. Ltd., 广州，中国）。重组枯草芽孢杆菌菌株在37°C下使用Tryptic Broth（TB）培养基培养。TB培养基的配方参考了Zhou等人的研究（2025）。重组大肠杆菌菌株在LB培养基中培养。

枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

重组质粒pP43NMK-gdh-6his的构建和转化

gdh基因和6.7 kb线性化载体分别以枯草芽孢杆菌基因组和pP43NMK质粒为模板，通过PCR扩增。电泳分析确认了gdh基因和线性化载体的完整性，两者均显示预期的单一条带（图1A-B）。线性化的pP43NMK载体通过同源重组与gdh基因重组，构建了重组质粒pP43NMK-gdh。随后对序列进行了验证

讨论

肉制品特有的红色通常依赖于亚硝酸盐的添加（Stoica et al., 2022）。然而，亚硝酸盐的添加引发了安全问题，因为它会生成N-亚硝胺（Bedale, Sindelar, & Milkowski, 2016）。研究表明，NOS-YkuN-YumC在绞肉中产生的着色效果与亚硝酸盐相似（Zhou, Li, et al., 2025）。然而，NOS-YkuN-YumC的活性取决于

结论

在本研究中，GDH在枯草芽孢杆菌 168中成功表达并纯化。SDS-PAGE分析确定纯化酶的分子量为约32 kDa，比活性为11.40 U/mg。NOS-YkuN-YumC和GDH的组合显著提高了低温条件下绞肉中的NO-Mb水平和< />。烹饪后，同时添加NOS-YkuN-YumC和GDH的绞肉保持了更高的< />

同意书

作者声明本研究未涉及任何人类受试者。

CRediT作者贡献声明

肖青：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验设计、数据整理。周亚莉：方法学设计。罗慧婷：方法学设计。陈丛贵：资源获取。徐宝才：资源获取。李培军：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金争取、概念构思。

未引用参考文献

美国食品药品监督管理局，2016

Xu et al., 2025

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：[32302142, 32172235]、安徽省重点科技项目（资助编号：[202423l10050057]以及中央高校基本科研业务费（资助编号：[JZ2024HGPB0264, JZ2024YQTD0600]的支持。本文的部分分析工作在合肥工业大学仪器分析中心完成。