《Neurobiology of Aging》：Human in vitro and rodent in vivo models highlight progressive mitochondrial dysfunction as a starting point of cerebral amyloidosis
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本研究聚焦阿尔茨海默病（AD）中淀粉样蛋白-β（Aβ）积累与线粒体功能障碍的因果关系。研究人员利用携带家族性AD（FAD）相关APP突变的人源神经祖细胞（ReN-APP）模型和转基因大鼠模型，系统揭示了在持续Aβ释放环境下，线粒体功能从早期氧化应激、动力学改变，到晚期膜电位丧失、线粒体自噬（mitophagy）受损的渐进性恶化过程。结果表明，线粒体异常是Aβ毒性的早期关键事件，为AD早期干预提供了潜在靶点。
在大脑这个耗能巨大的器官中，线粒体如同细胞的“动力工厂”，其正常运作对神经元存活至关重要。然而，在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的复杂病理画卷中，线粒体功能障碍已成为一个日益突出的特征。特别是由淀粉样蛋白-β（Aβ）异常聚集形成的脑淀粉样变性，与线粒体损伤之间存在着千丝万缕的联系。但一个关键问题悬而未决：在AD漫长的病理进程中，线粒体损伤究竟何时出现？是Aβ积累的因还是果？其恶化过程又是如何演进的？为了解开这些谜团，一项发表在《Neurobiology of Aging》上的研究为我们提供了新的见解。
传统研究多聚焦于AD晚期阶段，此时广泛的Aβ斑块沉积和神经元丢失已然存在，难以区分因果时序。另一些模型则通过外源性施加Aβ肽段来模拟急性毒性，这与AD患者体内长期、缓慢的Aβ病理积累存在差异。因此，揭示在持续、内源性Aβ产生背景下，线粒体功能随时间的动态变化，对于理解AD早期事件至关重要。
为了解决这一问题，研究人员设计了一项巧妙的研究。他们构建了两个核心模型系统：一个是人源的神经祖细胞系（ReN细胞），通过慢病毒转导稳定表达携带瑞典（Swedish, K670N/M671L）和伦敦（London, V717I）突变的淀粉样前体蛋白（APP），称为ReN-APP细胞；另一个是表达人APP（携带瑞典K670M/N671L和印第安纳Indiana V717F突变）的转基因（Tg）大鼠模型（McGill-R-Thy1-APP）。这两个模型均能模拟家族性AD（FAD）中Aβ的持续生成和积累。研究设定了早期和晚期两个时间点进行对比：体外模型为细胞分化后2周（早期）和6周（晚期），体内模型为大鼠3月龄（早期）和9月龄（晚期）。通过这一设计，团队得以追踪线粒体功能、动力学（融合与分裂平衡）和线粒体自噬清除能力在淀粉样变性进程中的演变。
研究采用的关键技术方法主要包括：利用慢病毒转导和荧光激活细胞分选（FACS）技术建立并富集稳定表达突变APP的ReN细胞系；通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像分析线粒体膜电位（使用TMRE染料）、活性氧（ROS，使用MitoSOX? Red指示剂）和线粒体网络形态（基于TOMM20染色并结合MitoSegNet深度学习软件进行形态计量学分析）；采用免疫荧光共定位（如TOMM20与LAMP2）评估线粒体-溶酶体共定位以指示线粒体自噬通量；通过免疫印迹（Western Blot）技术检测线粒体分裂蛋白DRP1、线粒体自噬关键蛋白PINK1、自噬标志物p62和LC3等在细胞和大鼠海马组织线粒体及总蛋白组分中的表达水平；并使用MSD V-PLEX Aβ Peptide Panel多重检测法定量Aβ40和Aβ42水平。大鼠海马组织通过差速离心法分离线粒体组分。
3.1. ReN-APP细胞展现功能性分化并分泌Aβ
研究人员成功构建了稳定表达突变APP（ReN-APP）和仅表达GFP的对照（ReN-GFP）细胞系。ReN-APP细胞能有效分化为神经元（βIII Tubulin阳性）和星形胶质细胞（S100β阳性）。与对照组（ReN-P）相比，ReN-APP细胞在分化2周和6周后均表现出Aβ42分泌显著增加，导致Aβ42/Aβ40比值升高，呈现淀粉样蛋白生成特征。至分化6周时，ReN-APP细胞出现神经元标记物阳性区域减少和细胞密度下降，表明出现了细胞损失。
3.2. 早期氧化失衡和晚期膜电位丧失表明进行性线粒体功能障碍
在分化2周的ReN-APP细胞中，虽线粒体膜电位（MMP）尚正常，但线粒体超氧化物（MitoSOX信号）已显著升高，而反映抗氧化能力的GSH/GSSG比值未见显著变化。至分化6周时，ReN-APP细胞不仅维持高水平的线粒体ROS，其MMP也显著降低，同时GSH/GSSG比值下降，表明氧化应激加剧并导致线粒体功能严重受损。
3.3. APP表达细胞系在早期和晚期均存在线粒体动力学紊乱
分化2周时，ReN-APP细胞的总DRP1（调控线粒体分裂的关键蛋白）水平已显著高于对照，但此时线粒体网络形态（基于TOMM20染色的分支长度和数量）尚未发生显著改变。至分化6周时，DRP1水平持续升高，并伴随线粒体平均分支长度缩短和线粒体数量增加，表明线粒体网络发生了明显的碎片化。
3.4. ReN-APP细胞晚期阶段线粒体自噬受损
分化6周时，ReN-APP细胞的线粒体自噬起始关键蛋白PINK1水平显著上调，提示线粒体自噬通路被激活以应对损伤。然而，线粒体标记物TOMM20与溶酶体标记物LAMP2的共定位分析（Manders系数）显示，ReN-APP细胞中线粒体与溶酶体的共定位显著减少，表明尽管自噬启动，但受损线粒体向溶酶体的递送和降解过程受阻，即线粒体自噬通量存在缺陷。
3.5. Aβ积累损害线粒体自噬流
在转基因大鼠模型中，3月龄Tg大鼠海马区可见细胞内Aβ积累，但线粒体相关的硝化应激标记物3-硝基酪氨酸（3-NT）水平和线粒体DRP1水平与野生型（WT）无差异。至9月龄时，Tg大鼠海马区出现细胞外Aβ斑块，且线粒体组分中3-NT水平和DRP1水平均显著升高，同时线粒体结合的PINK1水平也增加。进一步分析发现，9月龄Tg大鼠海马总蛋白组分中自噬底物p62和自噬体标志LC3-II/LC3-I比值均升高，且线粒体组分中p62也有所积累。这些结果共同表明，在疾病晚期，尽管线粒体自噬被激活（PINK1↑），但自噬流在后期步骤（如与溶酶体融合或降解）受阻（p62和LC3-II积累），导致受损线粒体清除障碍。
研究结论与讨论部分强调，这项研究通过互补的人源细胞和转基因大鼠模型，清晰地描绘了在持续内源性Aβ病理环境下，线粒体经历的进行性功能衰退。其演变路径可概括为：早期（分化2周/大鼠3月龄）即出现氧化应激（ROS升高）和线粒体分裂驱动蛋白DRP1的上调，但细胞抗氧化防御和线粒体网络形态尚能维持；随着病理进展至晚期（分化6周/大鼠9月龄），氧化应激加剧（GSH/GSSG降低，3-NT增加），导致线粒体膜电位丧失、网络明显碎片化，同时线粒体自噬通路虽被激活（PINK1升高）但其通量受损（线粒体-溶酶体共定位减少，p62/LC3-II积累），最终导致功能障碍线粒体累积，与观察到的细胞损失相吻合。
这项研究的重要意义在于，它确定了线粒体是Aβ毒性的早期易感靶点，其功能障碍在明显的Aβ斑块沉积和大规模神经元死亡之前即已启动并逐步恶化。这不仅深化了对AD发病机制的理解，更重要的是指出，针对线粒体稳态（包括氧化应激、动力学和自噬）的早期干预，尤其是在症状出现前的疾病阶段，可能成为延缓或阻止AD进展的有效策略。研究中所用的体外模型也为快速筛选相关保护性药物提供了有价值的平台。尽管研究揭示了明确的时序关系，但AD的复杂性意味着更精确的因果链条和细胞类型特异性效应仍有待未来研究进一步阐明。
