《Journal of Extracellular Biology》：Unconventional Secretion of Angiogenic Sonic Hedgehog–Containing Extra-Large Extracellular Vesicles is Driven by PI3K–Rab18-GDP Signalling
编辑推荐：
本文揭示了PI3K–Rab18-GDP信号通路在调控人间充质干细胞（hMSC）分泌富含Sonic Hedgehog（SHH）的超大细胞外囊泡（XLEV，直径>600 nm）中的核心作用。研究发现Rab18以其GDP结合形式（Rab18-GDP）作为关键调控因子，通过募集Hsp90α和中性鞘磷脂酶2（nSMase2），促进SHH-XLEV在核周区形成并实现极化分泌。这些具有强效促血管生成活性的XLEV，为理解发育与再生过程中血管生成信号传递提供了新框架。
引言
细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的重要媒介，通过传递蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子调控受体细胞功能状态。在人多细胞生物中，这种通讯方式不仅参与组织稳态维持，还在发育过程中形态发生梯度建立中发挥关键作用。人间充质干细胞（hMSC）来源的EVs因其再生潜能和能够降低同种异体细胞移植相关风险而备受关注。特别值得注意的是，将形态发生素Sonic Hedgehog（SHH）装载到hMSC来源的EVs中可显著增强其在缺血性心力衰竭模型中的治疗效果。然而，这一具有临床意义的EV亚类的形成和调控分泌的细胞机制尚未完全阐明。
Rab18-GDP诱导SHH富集XLEV分泌
研究发现，Rab拮抗剂CID1067700（CID）可特异性增强SHH-XLEV的分泌。通过免疫印迹分析证实，PI3K激动剂SF1670（SF）和CID处理均能促进hMSCs分泌SHH蛋白，而小EV标志物TSG101在各处理条件下均存在。密度梯度离心和纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，SHH阳性囊泡主要分布于高密度组分，且直径大于600 nm的XLEV仅出现在SF和CID处理组。透射电镜（TEM）观察进一步验证了CID处理后出现大量直径超过600 nm的脂双层结构囊泡。
SHH-XLEV的核周区分泌机制
时序成像显示，CID处理30分钟内SHH信号在核周区显著聚集。三维重构和晶格光片显微镜观察发现，管泡状SHH-XLEV（1-2 μm）特异性地从核周质膜区域分泌。这种空间限制性分泌模式表明XLEV的释放具有区域特异性。进一步实验证实，Hsp90抑制剂TAS-116和nSMase2抑制剂GW4869均能阻断CID诱导的SHH-XLEV分泌，提示Hsp90α和nSMase2活性是该过程的必要条件。
PI3K信号调控Rab18核周定位
PI3K信号通路被发现是Rab18依赖性过程的上游调控因子。PI3K抑制剂（ZSTK474或LY294002）处理导致Rab18阳性囊泡在胞质中弥散分布，而PI3K激动剂SF1670则诱导Rab18在核周区聚集。通过比较Rab18核苷酸状态突变体的定位发现，GDP结合型Rab18S22N突变体呈现显著核周聚集，而GTP结合型Rab18Q67L突变体则分散在胞质中。免疫荧光共定位分析显示Rab18-GDP与适配蛋白AP-1具有更强共定位，表明其定位于参与高尔基体到内体运输的内体区室。
效应分子募集与膜重塑机制
GST pull-down实验揭示Rab18-GDP特异性结合Hsp90α和nSMase2，而Rab18-GTP优先结合驱动蛋白KIF5A。这种核苷酸状态依赖性相互作用为SHH-XLEV前体在核周区的特异性成熟提供了分子基础。细胞实验证实Hsp90α与Rab18-GDP在核周内体共定位，且CID处理显著增加细胞外周神经酰胺积累，该效应可被GW4869抑制。表明Rab18-GDP通过促进nSMase2依赖性神经酰胺生成，参与局部膜重塑以利于SHH-XLEV形成。
分泌模式与功能特性
Rab18核苷酸状态差异调控SHH分泌模式：Rab18-GTP表达与SHH-N在细胞外基质中沉积相关，而Rab18-GDP促进核周区SHH-XLEV分泌。延长CID处理（24-30小时）可诱导形成富含Hsp90α的细胞外凝聚结构（20-40 μm），其中嵌有SHH-XLEV。功能实验表明，SF或CID诱导的hMSC分泌物能显著增强人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外成管能力，而SHHN-StayGold转染的HUVEC自身成管能力也显著提升，证实SHH是XLEV促血管活性的关键效应分子。
讨论与展望
本研究首次阐明PI3K–Rab18-GDP依赖性信号通路特异性调控SHH-XLEV的非常规分泌机制。该调控逻辑中GDP结合型Rab18促进大EV释放，不同于主流EV分泌模型强调GTP结合型Rab活性的观点。研究揭示了Rab18在整合空间组织和酶活性调控方面的核心作用：通过核苷酸状态依赖性效应分子募集（Hsp90α和nSMase2）和马达蛋白结合转换（驱动蛋白/动力蛋白），实现SHH-XLEV在核周区的特异性生物发生和极化分泌。这些发现为理解XLEV生物学及其在血管生成和再生信号传导中的作用提供了新范式。
