柘树中黄烷酮3-羟化酶与黄酮醇合酶的分子鉴定及功能多样性研究

《Plant Physiology and Biochemistry》：Molecular identification of flavanone 3-hydroxylase and flavonol synthase from Cudrania tricuspidata

本研究首次从药用植物柘树中成功鉴定并功能表征了两个黄烷酮3-羟化酶和一个黄酮醇合酶。研究人员通过体外酶活实验和拟南芥遗传互补实验，揭示了CtrF3H2具有更广泛的底物特异性，并通过定点突变阐明了其关键氨基酸位点。该研究不仅解析了柘树中重要活性黄酮醇类化合物的生物合成关键步骤，也为利用合成生物学技术提升植物中有益黄酮含量提供了理论依据和基因资源。

　　

在丰富多彩的植物王国里，类黄酮是一类广泛存在且具有重要生理功能的天然产物。它们不仅赋予花朵艳丽的色彩，帮助植物抵抗紫外线伤害，还在人类健康领域展现出巨大的应用潜力，如抗氧化、抗炎甚至抗癌活性。黄酮醇是类黄酮家族中的重要成员，而它们的生物合成依赖于两个关键酶：黄烷酮3-羟化酶和黄酮醇合酶。尽管药用植物柘树已知富含多种黄酮醇类化合物，但其生物合成路径中的这两个关键酶却一直是个谜。

为了揭开这个谜团，来自山东大学齐鲁医院药剂科的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们首次从柘树中成功鉴定出两个F3H酶和一个FLS酶，并系统解析了它们的催化特性和生物学功能。这项工作不仅填补了柘树类黄酮生物合成路径的关键空白，更为深入理解植物次生代谢的多样性提供了新的视角。

研究人员运用了转录组数据库挖掘、基因克隆与异源表达、蛋白质纯化与体外酶活分析、酶动力学测定、同源建模与分子对接、定点突变以及拟南芥遗传互补实验等关键技术方法。其中，植物材料来自山东省沂水县柘树研究所，拟南芥突变体为重要的实验材料。

3.1. 柘树中F3H和FLS的鉴定

通过对柘树叶片的转录组数据库进行关键词搜索，研究人员成功鉴定出一个FLS候选基因和两个F3H基因。序列分析显示，CtrF3H1和CtrF3H2仅有五个氨基酸差异，但它们都含有2-ODD家族典型的保守结构域。系统进化分析进一步证实了它们的功能分类，为后续的功能研究奠定了基础。

3.2. F3H的功能表征

体外酶活实验表明，CtrF3H1和CtrF3H2都能有效催化柚皮素和圣草酚转化为相应的二氢黄酮醇。然而，CtrF3H2展现出更广泛的底物特异性，还能催化橙皮素、甘草素和松属素，而CtrF3H1对这些底物的活性较弱或没有活性。酶动力学分析显示，CtrF3H1对柚皮素具有更高的催化效率，而CtrF3H2对橙皮素和甘草素的催化效率更优。

3.3. 定点突变增强CtrF3H1的底物异质性

通过同源建模和分子对接，研究人员发现第78位氨基酸是影响酶底物特异性的关键位点。将CtrF3H1的第78位天冬酰胺突变为天冬氨酸后，突变体的底物特异性变得与CtrF3H2相似，能够催化更多种类的黄烷酮底物。这一发现从分子水平上阐释了酶功能多样性的机制。

3.4. FLS的功能表征

研究人员证实CtrFLS能够催化二氢山奈酚和二氢槲皮素分别转化为山奈酚和槲皮素，表现出典型的黄酮醇合酶活性。酶动力学分析显示CtrFLS对二氢山奈酚具有良好的催化效率，为其在植物体内的功能提供了体外证据。

3.5. CtrF3H1和CtrFLS在拟南芥中的功能验证

通过在拟南芥突变体中的遗传互补实验，研究人员进一步验证了这两个酶在植物体内的功能。CtrF3H1在tt6突变体中的过表达不仅部分恢复了黄酮醇含量，还意外地提高了芹菜素和金圣草黄素等黄酮的含量，显示出CtrF3H1的功能多样性。同时，CtrFLS在fls突变体中的过表达显著提高了黄酮醇水平，证实了其在植物体内的黄酮醇合酶功能。

这项研究系统地阐明了柘树中黄酮醇生物合成的分子基础。研究人员不仅成功鉴定出关键的F3H和FLS酶，还深入解析了它们的催化特性和功能多样性。特别值得关注的是，研究发现单个氨基酸的替换就能显著改变酶的底物特异性，这为理解酶功能进化提供了重要线索。此外，CtrF3H1在植物体内表现出的功能多样性，包括同时影响黄酮醇和黄酮的生物合成，拓展了我们对植物次生代谢网络复杂性的认识。

这些发现不仅具有重要的理论意义，也为通过代谢工程手段提高药用植物中有益黄酮类化合物的含量提供了宝贵的基因资源和策略参考。随着对植物次生代谢途径认识的不断深入，我们有理由相信，未来能够更精准地调控目标化合物的合成，从而更好地利用植物资源服务于人类健康。