《Scientia Horticulturae》：Conservation of wild
Solanum germplasm based on seed cryopreservation and slow growth conservation
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本研究针对云南西双版纳地区野生茄属（Solanum）种质资源因城市化导致遗传多样性下降的紧迫问题，系统开展了基于种子超低温保存（cryopreservation）与离体缓慢生长保存（slow growth conservation）的保护技术研究。研究人员优化了9份耐低温种质的种子含水量（8%–10%）与保存时长参数，并针对6份低温敏感种质建立了基于子叶器官发生途径的不定芽诱导及缓慢生长保存体系。研究证实再生植株在形态、生理及DNA水平均保持稳定。该研究为稳定保存S. undatum及其近缘种提供了关键技术支撑，并为保护民族蔬菜遗传资源、促进茄科育种及生物多样性保护的可持续发展奠定了基础。
在云南西双版纳的傣族和哈尼族聚居区，生长着一类特殊的植物资源——野生茄属（Solanum）植物。它们不仅是当地少数民族的传统蔬菜和草药，更是植物遗传多样性宝库中的关键组成部分。然而，随着城市化进程的快速推进，这些宝贵的野生资源正面临着遗传多样性急剧下降的威胁，建立科学有效的保护体系刻不容缓。
面对这一挑战，研究人员将目光投向了两种先进的生物技术：种子超低温保存（cryopreservation）和离体缓慢生长保存（slow growth conservation）。超低温保存能将种质在-196°C的液氮中“冻结时光”，实现长期稳定保存；而缓慢生长保存则通过调控培养条件，显著延长离体材料的继代周期，是那些对超低温敏感种质的理想替代方案。
为了系统评估并建立适用于野生茄属种质的保护技术，本研究选取了15份来自云南傣族和哈尼族聚居区的、经过自交纯化的野生茄属（以S. undatum为代表）及其近缘种质资源。研究遵循“种质评价-保存体系建立-遗传稳定性验证”的技术路线，旨在回答一个核心问题：如何为这些具有重要潜在价值的野生资源，量身定制一套安全、可靠且能维持其遗传完整性的中长期保存方案？
研究发现，种质资源对超低温保存的耐受性存在显著差异。在15份材料中，9份被鉴定为耐低温种质（如NQ1, HQ4, YQ25等），其种子在8%-10%的含水量下，经历30天的超低温保存后，仍能保持较高的存活率（>79%）和再生率（>70%）。研究进一步明确，种子含水量是影响保存效果的关键参数，而过长或过短的保存时间在适宜的含水量范围内对种子活力影响不大。值得注意的是，再生后的植株在形态和生理指标上均与对照无显著差异，利用ISSR和RAPD分子标记进行的DNA结构分析也证实了其遗传稳定性。
然而，另有6份材料（YQ13, GQ50, YQ54等）被鉴定为低温敏感型，其种子难以通过常规超低温保存技术进行有效保护。针对这一难题，研究人员另辟蹊径，为其建立了一套“不定芽诱导-缓慢生长保存”的离体保存技术体系。研究筛选出高效的不定芽诱导培养基（“MS + 30 g/L sucrose + 7 g/L agar + 2.0 mg/L ZT + 0.1–0.2 mg/L NAA”），显著提高了不定芽的诱导数量和效率。更重要的是，研究人员成功筛选出适合缓慢生长的培养基（“1/4 MS + 60 g/L sucrose + 9 g/L agar + 75–100 mg/L CCC + 0.1 mg/L ABA”），该培养基能在确保植株存活的前提下，有效抑制茎的伸长，将继代周期从常规的30天延长至60天。恢复培养的植株仅在根生物量上略低于对照，其他性状及DNA均未发生明显变异，证明了该保存方法的可靠性。
为了验证保存技术的可靠性，研究从形态、生理和DNA三个维度对再生植株进行了系统性评估。形态学分析显示，绝大多数保存后再生植株的株高、茎粗、叶数、叶面积、根长和根面积等指标与对照无显著差异。生理指标检测发现，抗氧化酶（CAT, SOD, POD）活性、可溶性蛋白含量及光合色素含量在大部分种质中也保持稳定。分子标记分析（使用3条ISSR和3条RAPD引物）进一步表明，再生植株的DNA条带与对照相比，仅极少数组合出现轻微多态性，遗传结构保持高度稳定。
本研究成功构建了针对野生茄属种质资源的差异化保护策略：对耐低温种质，优化其种子超低温保存技术；对低温敏感种质，则建立基于不定芽诱导的缓慢生长离体保存体系。该研究不仅填补了热带亚热带野生茄属资源保存技术的空白，为将其遗传资源安全、稳定地转化为育种创新的“基因库”提供了关键技术支撑，更因其研究对象是傣族、哈尼族的传统蔬菜，间接保护了民族饮食文化的物质载体，实现了遗传资源保护、文化传承与育种应用的三重价值。
关键技术方法概述
本研究综合利用了多种关键技术。种质材料来源于云南西双版纳地区经过连续两代自交纯化的野生茄属资源。研究核心包括：1） 通过种子脱水控制含水量（5-7%, 8-10%, 11-13%）并进行超低温保存（-196°C液氮）；2） 针对低温敏感材料，以子叶为外植体，在添加特定植物生长调节剂（如ZT和NAA）的MS培养基上进行不定芽诱导，建立离体无菌体系；3） 对获得的组培苗，在添加生长抑制剂（如CCC）和脱落酸（ABA）的缓慢生长培养基上进行中期保存，以延长继代周期；4） 采用形态观测、生理指标（抗氧化酶活性、光合色素含量）测定以及分子标记（ISSR, RAPD）分析，系统评估保存前后材料的遗传稳定性。
研究结果
3.1. 15份茄属种质资源的形态特征
对15份种质的定性性状（如生长习性、分枝强度、叶形、果色等）和定量性状（株高、叶长、果长等）进行分析。Shannon多样性指数（H‘）和变异系数（CV）计算表明，这些种质在形态上具有丰富的遗传多样性，例如商品果色的H’高达1.37，果长的CV高达74.0%，为后续差异化保存策略的制定提供了材料基础。〈img src="
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304423826000403-gr2.jpg " caption="图2. 15份S. undatum及其近缘种质定性性状分布频率"> 〈img src="
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304423826000403-gr3.jpg " caption="图3. 15份S. undatum及其近缘种质定量性状分布频率">
3.2. 超低温保存后种子的存活与再生
种子含水量和保存时长显著影响超低温保存效果。对于9份耐低温种质，在8-10%的种子含水量下，保存30天仍能保持较高的存活率和再生率（如HQ4存活率>95%，再生率>93.3%）。而含水量过高（11-13%）或过低（5-7%）均导致效果下降。保存时长在适宜含水量范围内对保存效果影响不显著。相反，6份低温敏感种质（如YQ13, GQ50）即使在优化条件下，存活率和再生率也始终较低（如YQ13存活率<26.7%），表明其不适合直接进行种子超低温保存。多元方差分析（MANOVA）表明，基因型是影响超低温保存效率的最关键因素。
3.3. 超低温保存后种子的再生过程
超低温保存后的种子在萌发和再生进程上略慢于对照，且部分种子仅萌发胚根未能成苗（记为“存活”）。保存后的种子颜色变深，提示可能发生了氧化损伤。
3.4. 超低温保存种子再生植株的形态稳定性
保存60天后，9份耐低温种质再生植株的株高、茎粗、叶数、叶面积、根长和根面积等形态指标与对照相比，绝大多数无显著差异，仅在个别种质（如HQ4的株高，YQ25和YQ40的根长）的特定指标上出现显著差异，表明形态稳定性良好。
3.5. 超低温保存种子再生植株的生理及DNA结构稳定性
生理指标方面，大部分种质的CAT、SOD、POD活性、可溶性蛋白含量及光合色素含量与对照无显著差异，仅个别种质（如YQ48的CAT，YQ25和YQ92的SOD）的特定指标有变化。DNA分子标记（ISSR, RAPD）检测显示，绝大多数引物在再生植株中未检测到多态性条带，仅极少数组合（如NQ1使用RAPD引物OPH-16有多态性）出现轻微变异（多态性百分比<6.7%），证明DNA结构高度稳定。〈img src="
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304423826000403-gr5.jpg " caption="图5. ISSR引物856在9份耐低温种质超低温保存再生植株基因组DNA中的扩增条带">
3.6. 子叶不定芽诱导
针对6份低温敏感种质，建立了以子叶为外植体的不定芽诱导体系。在9种诱导培养基中，LO5（MS+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA）和LO6（MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L NAA）培养基表现最优，能诱导产生较多的不定芽（如YQ85在LO5上平均每外植体产生4.3个芽），且愈伤组织诱导率高（>60%），死亡率低（<40%），植株再生率高（>70%）。基因型、培养基及其互作对诱导效率有极显著影响。
3.7. 不定芽的微滴玻璃化法超低温保存
尝试对6份低温敏感种质的不定芽来源的茎尖进行微滴玻璃化法（droplet-vitrification）超低温保存。结果显示，所有种质的茎尖再生率均低于12%，表明该类种质不适合采用茎尖超低温保存策略。〈img src="
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304423826000403-gr6.jpg " caption="图6. S. undatum及其近缘种质子叶不定芽诱导类型（A）以及缓慢生长保存恢复培养后植株形态（B,C）和生理指标（D）变异">
3.8. 离体植株缓慢生长保存
评估了8种缓慢生长培养基（RG1-RG8）对6份低温敏感种质离体植株的保存效果。其中，RG7（1/4 MS + 60 g/L sucrose + 9 g/L agar + 75 mg/L CCC + 0.1 mg/L ABA）和RG8（1/4 MS + 60 g/L sucrose + 9 g/L agar + 100 mg/L CCC + 0.1 mg/L ABA）培养基效果最佳，能在保持高存活率（大多≥80%）和高再生率（≥70%）的同时，实现较高的生长抑制率（75.0%–83.7%），有效延长了继代周期。
3.9. 缓慢生长保存再生植株的形态稳定性
缓慢生长保存恢复培养后，6份种质再生植株的地上部分形态指标（株高、茎粗、叶数、叶面积）与常规继代保存的对照植株相比，大多无显著差异。但部分种质（如YQ13, YQ54, GQ74）的根系指标（根长、根面积）出现显著差异，表明缓慢生长保存对根系发育有一定影响。
3.10. 缓慢生长保存再生植株的生理及DNA结构稳定性
生理指标上，大部分种质的CAT、SOD、POD活性、可溶性蛋白及光合色素含量与对照无显著差异，仅少数种质（如GQ50的可溶性蛋白，YQ54的光合色素）的个别指标有显著变化。DNA分子标记分析显示，仅YQ54种质在使用RAPD引物OPA-20时检测到轻微条带多态性（多态性百分比6.4%），其他引物和种质均未发现明显DNA结构变异。〈img src="
https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0304423826000403-gr7.jpg " caption="图7. RAPD引物OPA20在6份低温敏感种质缓慢生长保存再生植株基因组DNA中的扩增条带">
研究结论与意义
本研究成功为15份野生茄属种质资源建立了差异化的保存技术体系。对于9份耐低温种质，明确了其种子超低温保存的最佳条件（种子含水量8%-10%），证实该技术能长期稳定保持种质活力且不引起遗传变异。对于6份低温敏感种质，创新性地建立了基于高效不定芽诱导和缓慢生长保存的离体保存技术，找到了能有效延缓生长、保持植株活力的培养基配方（RG7/RG8），为解决此类难保存资源的保护难题提供了可行方案。通过多维度（形态、生理、DNA）稳定性验证，确保了保存后再生材料的遗传完整性。
该研究的重要意义在于：首先，它系统解决了热带亚热带野生茄属资源保存中的关键技术瓶颈，为这类资源的安全、长期保存提供了可靠的技术范例和理论依据。其次，研究所针对的S. undatum及其近缘种是云南少数民族地区重要的传统蔬菜和药用资源，该保护工作的开展不仅有助于保护农作物野生近缘种的遗传多样性，也为未来茄科蔬菜的抗性育种、品质改良及功能基因挖掘提供了宝贵的基因资源。最后，该研究将超低温保存与离体缓慢生长保存两种技术有机结合，根据材料特性实施差异化策略，这种研究思路对其它类似难保存的植物资源也具有重要的借鉴价值。本研究发表于《Scientia Horticulturae》，为野生植物遗传资源的有效保护与可持续利用贡献了重要力量。
