《Immunity》：Scalable TCR synthesis and screening enable antigen reactivity mapping in vitiligo
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本研究开发了TCRAFT（T细胞受体快速组装功能测试）技术，能够低成本、高通量地合成数万个配对的TCRαβ库，并结合RAPTR（靶向逆转录病毒受体-抗原配对）平台进行文库对文库的筛选。研究人员利用该技术对来自白癜风患者水疱液的3,808个TCR克隆型进行了筛选，成功鉴定了针对MART-126-35、gp100280-288等黑素细胞相关抗原的特异性TCR，并揭示了其与黑色素瘤中肿瘤反应性T细胞相似的终末耗竭表型。该研究为自身免疫病和癌症中T细胞抗原特异性的高通量解码提供了强大工具。
在免疫学的广阔战场上，T细胞如同精准的特种部队，其识别“敌人”——抗原——的能力依赖于细胞表面的T细胞受体（TCR）。然而，解码数以万计的TCR究竟识别哪些特定抗原，一直是领域内的巨大挑战。传统的TCR功能验证方法耗时费力、成本高昂，严重限制了我们对T细胞在感染、自身免疫病和癌症中作用机制的深入理解。特别是在白癜风这类自身免疫性皮肤病中，虽然已知黑素细胞是免疫系统攻击的靶点，并且与黑色素瘤共享部分抗原，但驱动疾病发生的具体TCR及其识别的抗原全景图仍然模糊不清。能否开发一种高效、低成本的方法，一次性合成并筛选数万个TCR，从而大规模绘制TCR-抗原相互作用图谱？这正是来自美国麻省理工学院等机构的研究团队在《Immunity》杂志上发表的研究旨在解决的核心问题。
为了突破这一瓶颈，研究人员开发了一套名为TCRAFT（TCR Rapid Assembly for Functional Testing，T细胞受体快速组装功能测试）的集成化技术流程。该研究的几个关键技术方法包括：1） 利用改进的金门组装（Golden Gate Assembly）技术，通过精心设计的正交4碱基突出端，实现了在单一反应体系中并行、精确地组装数千个配对的TCRαβ受体库，成本降至每个TCR不足1美元。2） 将TCRAFT与RAPTR（Receptor-antigen pairing by targeted retroviruses，通过靶向逆转录病毒进行受体-抗原配对）技术相结合，利用展示有pMHC（肽-主要组织相容性复合体）的慢病毒库，对TCR库进行“一锅法”的高通量功能性筛选，从而直接获得配对的TCR-抗原信息。3） 对来自10名HLA-A*02:01阳性白癜风患者水疱液的T细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq），获取了3,808个天然配对的TCR序列用于构建文库。此外，研究还使用了基于Jurkat J76细胞的NFAT报告基因系统来检测TCR激活。
模块化组装用于功能性测试的TCR库
研究团队首先从测序数据中低成本、大规模地组装TCR库。TCRAFT方法的核心在于使用包含TCRα链和β链可变区（TRAV和TRBV）和恒定区（TRAC和TRBC）基因的载体池，以及包含链接的CDR3α/β序列的寡核苷酸池。通过三级金门组装反应，将CDR3α/β寡核苷酸与对应的TRAV和TRBV基因精确配对，最终生成完整的、合成格式的TCR（TRBV-TRBC-P2A-TRAV-TRAC）并克隆到表达载体中。该方法的关键创新在于利用大量实验数据优化设计了高度正交的4碱基对突出端，确保了在混合池反应中不同组件之间的正确连接，组装正确率超过99%。研究人员成功合成了包含3,808个来自白癜风病灶的TCR库，并通过纳米孔长读长测序验证了其高质量。
白癜风3,808个TCR库的联合组装与表征
为了探究白癜风中TCR的反应性，研究人员从10名HLA-A*02:01阳性白癜风患者的水疱液中鉴定出3,808个TCR，并利用TCRAFT技术成功将其组装成库。测序分析显示，99.1%的序列是正确的配对，成功检测到98.7%的TCR，频率分布均匀，证明了该方法的高效性和可靠性。
利用pMHC假型化慢病毒进行文库对文库的TCR-抗原筛选
接下来，研究团队将这3,808个TCR库导入一个克隆性的TCR缺失的Jurkat J76细胞系，该细胞系带有NFAT-CFP报告基因。为了筛选这些TCR的反应性，他们构建了一个包含101种HLA-A2结合表位的pMHC假型化慢病毒库，这些表位包括白癜风相关抗原、黑色素瘤相关抗原和已知病毒抗原。用这个病毒库刺激TCR库细胞后，通过流式细胞术分选被激活（NFAT-CFP阳性）且被病毒转导（GFP阳性）的细胞，并进行10x Genomics单细胞RNA测序，从而同时捕获反应的TCR信息和其识别的pMHC条形码。通过这种创新的单细胞RAPTR工作流程，他们成功地将特定的TCR克隆型与它们所识别的抗原（如MART-126-35类似物和gp100209-217类似物）配对，实现了高通量的TCR-抗原配对鉴定。
利用肽段脉冲的抗原呈递细胞检测和验证抗原反应性TCR
为了验证单细胞RAPTR工作流程的结果，并与更常规的抗原筛选方法兼容，研究人员还用肽段脉冲的抗原呈递细胞（T2细胞）对TCR库进行了筛选。他们使用了包含561种抗原的肽段库，其中包括已知的白癜风表位、扩展的黑色素瘤相关抗原、病毒抗原等。刺激后，对激活的细胞进行分选和TCR测序，再次鉴定出抗原反应性TCR。结果表明，两种筛选方法（病毒库和肽段脉冲APC）的结果高度一致，共同鉴定出187个独特的抗原反应性TCR克隆型，其中138个对黑素细胞抗原有反应，38个对病毒抗原有反应。对部分TCR进行单个克隆验证，进一步确认了其抗原特异性。
白癜风水疱液TCR的表型和抗原反应性
通过整合单细胞转录组数据和TCR特异性信息，研究人员深入分析了白癜风中抗原特异性T细胞的基因表达程序。他们发现，对黑素细胞抗原（如MART-1）有反应的T细胞主要富集在具有细胞毒性特征的CD8+T细胞簇中，高表达颗粒酶（GZMA, GZMB等）、穿孔素（PRF1）以及效应分子IFN-γ和CCL4/5，同时也表达耗竭标志物如PD-1（PDCD1）和TIGIT。这些T细胞表现出组织驻留记忆T细胞（TRM）的特征，如表达ZNF683 (HOBIT) 和CD69。重要的是，与黑色素瘤肿瘤反应性T细胞的基因签名进行比较发现，白癜风中的黑素细胞反应性T细胞与黑色素瘤中的终末耗竭（TTE）T细胞签名高度相似，共享CCL5、GZMB等基因表达特征。这提示在慢性抗原刺激下，自身免疫和肿瘤环境中的抗原特异性T细胞可能趋同于相似的耗竭/细胞毒性状态。研究还发现，识别MART-1的TCR倾向于使用特定的TRAV12-2和TRBV19可变区基因片段，并且这些TCR在序列上具有较高的相似性（通过TCRdist分析），表明了对共享抗原的公共TCR反应。
30,000+ TCR库的组装与抗原反应性筛选
为了进一步展示TCRAFT技术的可扩展性，研究人员从一个更大的队列（包括胰腺导管腺癌（PDAC）患者的肿瘤浸润淋巴细胞和外周血单核细胞）中合成了一个包含30,810个TCR的库。同样，组装效率和准确性非常高（99.1%正确配对，99.6%的TCR被检测到）。用肽段脉冲的T2细胞对该巨型TCR库进行筛选，成功鉴定出对巨细胞病毒（CMV）衍生抗原NLV等有反应的低频TCR，证明了该方法从海量TCR库中灵敏地发现稀有抗原特异性TCR的能力。
本研究成功开发并验证了TCRAFT这一强大的技术平台，它极大地降低了大规模、配对TCR库合成与筛选的成本和技术门槛。应用该技术，研究首次在白癜风中对数千个TCR进行了系统性的抗原特异性图谱绘制，揭示了黑素细胞反应性TCR的克隆优势、转录表型及其与肿瘤微环境中T细胞的相似性。这些发现不仅增进了对白癜风发病机制的理解，也为利用共享抗原开发针对自身免疫病和癌症的免疫疗法提供了新的视角和靶点。更重要的是，TCRAFT与多种抗原发现平台（如RAPTR、T-Scan、pMHC多聚体等）的兼容性，使其成为一个可广泛应用的强大工具，将极大地推动TCR免疫组库解码、疫苗设计和个性化T细胞治疗的发展。
