《Human Vaccines & Immunotherapeutics》：Development of HPV 35 serology assays for assessment of immune responses to HPV 35 after infection and vaccination
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本文开发并验证了针对HPV 35的血清学检测方法——酶联免疫吸附测定（ELISA）和基于假病毒的中和试验（PBNA），成功制备了包含L1/L2衣壳蛋白的病毒样颗粒（VLP）和假病毒颗粒（PsV）。ELISA临界值为9.8 EU/mL，组内相关系数（ICC）达0.995；PBNA临界值为10，ICC为0.931。这些高重现性方法为评估现有疫苗交叉保护效果及新一代疫苗研发提供了关键工具，尤其对HPV 35高发的非洲裔和HIV感染人群的宫颈癌防控具有重要意义。
引言
人乳头瘤病毒（HPV）是一种无包膜DNA病毒，全球约5%的癌症与其相关。HPV 16和18是导致宫颈癌的主要型别，但HPV 35约占全球浸润性宫颈癌病例的2%，在非洲裔女性中比例更高（4%-10%）。现有HPV疫苗均未覆盖HPV 35，因此需明确当前疫苗是否对其具有交叉保护作用。血清学检测是评估免疫反应的关键手段，其中ELISA可量化抗体结合水平，PBNA则是衡量中和活性的金标准。本研究旨在建立并验证针对HPV 35的ELISA和PBNA方法，为相关研究提供工具。
材料与方法
样本来源：研究使用哥斯达黎加HPV疫苗试验（CVT）中30名持续感染HPV 35女性的血清样本，其中15人接种了二价疫苗（Cervarix），15人接种对照甲肝疫苗。另从健康供者获取阴性对照血清。
VLP与PsV制备：通过转染293TT细胞生产HPV 35 L1L2 VLP和PsV，经透射电镜（TEM）验证结构完整性，并通过单克隆抗体特异性测试确认VLP型别特异性。
ELISA与PBNA优化：ELISA采用HRP标记二抗和TMB显色，以9.8 EU/mL为临界值；PBNA以SEAP报告基因检测中和活性，临界值设为10。两者均通过空白限（LOB）分析确定cutoff，并计算组内相关系数（ICC）和变异系数（CV）评估重复性。
结果
VLP与PsV验证：TEM显示VLP和PsV呈典型聚集体结构（图1）。ELISA特异性实验中，HPV 35单抗（HPV35.Q8）吸光度（OD）达1.29，其他型别单抗OD均低于0.006（图2A）。PsV感染性实验筛选出高信号片段（RLU 20万-60万），最终确定1:4000为PBNA最佳稀释浓度（图2B-D）。
ELISA性能：临界值9.8 EU/mL，ICC为0.995，总CV为7.8%，表明方法重现性极佳（图3）。
PBNA性能：所有阴性样本中和滴度均<10，ICC为0.931，CV为29.9%，与HPV 16 PBNA的变异水平相当（图4）。
讨论
HPV 35在非洲裔和HIV感染女性中高发，且与宫颈癌治疗失败相关。尽管其与HPV 16遗传相似可能带来交叉保护，但现有疫苗效果仍需验证。本研究建立的ELISA和PBNA具备高灵敏度和重现性，为评估疫苗免疫原性及HPV 35流行病学研究奠定基础。局限性在于未包含HPV 35疫苗接种者样本，且样本均来自哥斯达黎加女性。未来需在HPV 35高发地区（如撒哈拉以南非洲）及男性群体中进一步应用这些方法，以优化疫苗策略并降低相关癌症负担。
伦理声明：所有研究遵循《赫尔辛基宣言》，受试者均签署知情同意书，方案经美国国家癌症研究所（NCI）和哥斯达黎加伦理委员会批准。
