《Cell Genomics》：CRISPR activation screens map the genomic landscape of cancer glycome remodeling
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本研究针对癌症细胞通过表面聚糖重塑逃避免疫监视的机制尚不明确的问题，利用CRISPR激活筛选技术系统性鉴定调控Siglec配l体表达的关键基因。研究发现ST3GAL家族唾液酸转移酶及GAL3ST4等磺基转移酶是驱动Siglec-7/9/10配体表达的核心因子，并揭示CD44、CSPG4等蛋白可作为“专职配体”增强Siglec结合。该研究构建了迄今最全面的癌症相关糖基化调控图谱，为开发靶向Glyco-免疫检查点的疗法提供了新靶点。
癌症细胞能够通过改变细胞表面的糖分子修饰来逃避免疫系统的攻击，这一过程被称为“糖组重塑”。特别值得注意的是，癌细胞会大量增加一种名为唾液酸的糖分子在细胞表面的表达。这些唾液酸能够与免疫细胞表面的Siglec受体结合，进而抑制免疫细胞的活性，相当于给免疫细胞上了“刹车”。然而，科学家们对于癌细胞是如何精确调控这一复杂过程的遗传基础仍知之甚少。哪些基因的异常表达导致了这些免疫抑制性糖配体的产生？是否存在某些关键的“开关”基因？回答这些问题对于开发新的癌症免疫疗法至关重要。
为了系统性地回答这些问题，研究人员在《Cell Genomics》上发表了他们的最新研究成果。他们采用了一种强大的功能基因组学工具——CRISPR激活筛选技术。这项技术不同于传统的基因敲除，它能够高效地过表达人类基因组中的每一个基因。研究团队构建了携带CRISPR激活系统的K-562白血病细胞模型，并利用覆盖全基因组的sgRNA文库，使细胞群体中的每个基因都有机会被单独激活。随后，他们使用分别结合Siglec-7、Siglec-9和Siglec-10的Fc融合蛋白来检测细胞表面相应配体的表达水平。通过流式细胞分选技术，他们将配体表达最高和最低的细胞群体分选出来，并通过测序分析哪些基因的激活会导致Siglec配体表达的增加或减少。
关键技术方法概览
本研究的关键技术方法包括：1）基于CRISPR/dCas9的基因组尺度激活筛选技术，用于系统性发现调控Siglec-Fc结合的基因；2）流式细胞术结合Fc嵌合蛋白染色，用于定量检测细胞表面Siglec配体的表达水平；3）CasTLE生物信息学分析流程，用于统计鉴定显著性调控基因；4）针对特定基因的CRISPR/Cas9基因敲除验证实验；5）利用癌症基因组图谱公共数据库进行基因表达与患者预后的相关性分析。研究所用细胞系包括K-562、OCI-AML-2、LN-229等，部分临床相关性分析基于TCGA中的低级别胶质瘤患者队列数据。
研究结果
基因组尺度CRISPRa筛选系统绘制Siglec配体表达调控图谱
研究人员通过三轮独立的筛选，分别绘制了调控Siglec-7、-9和-10配体表达的基因图谱。结果显示，唾液酸转移酶家族是最强的正调控因子。其中，ST3GAL家族成员对Siglec-7配体表达促进作用尤为显著，而ST6GAL1的激活则特异性增强Siglec-10的结合。有趣的是，筛选结果揭示了唾液酰化与GlcNAc基化途径之间的“生物合成竞争”关系，例如GCNT1、B3GNT3等基因的过表达会拮抗Siglec配体的形成。此外，研究还鉴定出CD44、CSPG4、LRRC15等多个细胞表面蛋白作为潜在的Siglec“专职配体”。
不同Siglec受体对聚糖类型表现出选择性结合特性
深入研究后发现，不同Siglec受体对聚糖类型具有明显的选择性。Siglec-7的配体表达主要受O-聚糖唾液酰化酶调控，而Siglec-10则更倾向于结合N-连接聚糖。令人意外的是，曾被广泛报道为Siglec-10配体的CD24，在本研究的模型体系中并未显示出调控作用。相反，CSPG4和CD44被确认为新型的Siglec-9高亲和力配体。这些发现提示，不同的Siglec受体可能通过识别不同类型的糖蛋白和糖链结构来行使免疫调节功能。
磺基转移酶GAL3ST4是胶质瘤中Siglec-7配体表达的关键驱动因子
通过对筛选结果进行生物信息学挖掘，研究人员发现磺基转移酶GAL3ST4在低级别胶质瘤中是一个显著的不良预后因子。实验验证表明，在胶质瘤细胞系LN-229中敲低GAL3ST4可显著降低Siglec-7-Fc的结合，而回补实验则能恢复结合能力。进一步酶处理实验提示，Siglec-7可能结合一种新型的“3-磺酸-6-唾液酸核心1”O-聚糖结构。这一发现不仅揭示了GAL3ST4是胶质瘤免疫逃逸的新驱动因子，也拓展了人们对Siglec-7配体结构多样性的认识。
研究结论与意义
本研究通过大规模的CRISPR激活筛选，首次构建了癌症细胞Siglec配体表达的全局性遗传调控图谱。该图谱揭示了不同Siglec受体配体表达的复杂性和特异性，强调了唾液酰化与其它糖基化修饰途径之间的精细平衡在调控免疫检查点中的核心作用。研究鉴定出的关键调控基因，如ST3GALs、GAL3ST4等，以及新型配体蛋白，如CD44、CSPG4，为开发靶向Glyco-免疫检查点的疗法提供了丰富的候选靶点。更重要的是，研究发现不同的癌症类型可能利用不同的遗传途径来实现糖组重塑和免疫逃逸，这意味着未来的治疗策略可能需要根据肿瘤的特定糖基化谱进行个性化设计。这项研究极大地深化了我们对癌症糖免疫学的理解，为下一代免疫疗法的开发奠定了坚实的理论基础。
