《Science Signaling》：EGFR activation sensitizes trigeminal NMDA receptors to promote pain and morphine analgesic tolerance in oral cancer
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本研究针对口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者使用阿片类药物镇痛易产生耐受的临床难题，揭示了肿瘤微环境中表皮生长因子受体(EGFR)信号通过敏化三叉神经节(TG)神经元上的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)，从而加剧疼痛并促进吗啡耐受的新机制。研究人员发现EGFR抑制剂可有效缓解小鼠口腔癌疼痛并恢复吗啡镇痛效果，为临床转化提供了新策略。
口腔癌，特别是口腔鳞状细胞癌(OSCC)，是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，患者常遭受剧烈疼痛的折磨，严重影响进食、饮水和言语等基本功能。阿片类药物虽然是目前癌痛管理的金标准，但OSCC患者相比其他慢性疼痛患者对阿片类药物的反应更差，且更快产生耐受。随着耐受的发展，需要不断增加药物剂量，这不仅导致成瘾等严重副作用，还可能延长住院时间并增加再入院率。然而，口腔癌疼痛和阿片类药物耐受背后的机制尚不完全清楚。与此同时，表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在80%至100%的OSCC病例中存在异常激活，针对EGFR的抗体和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)已被美国FDA批准用于治疗包括OSCC在内的多种癌症。临床观察发现，使用EGFR抑制剂的患者神经病理性疼痛（包括癌痛）得到缓解。基础研究也提示EGFR及其配体（如肝素结合性EGF(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGFα)）与疼痛性疾病相关。在动物模型中，HB-EGF能直接引起背根神经节(DRG)神经元兴奋并诱发疼痛样行为。EGFR也被证实与阿片耐受有关。尽管已有研究揭示了EGFR在非癌性疼痛模型中通过激活TRPV1、PI3K-AKT-mTOR通路、MMP-9或KRAS-BH4通路来增加疼痛敏感性，但这些研究多集中于脊髓水平，且EGFR在疼痛中的作用具有配体和疾病特异性。因此，在涉及三叉神经系统的口腔癌疼痛和阿片镇痛耐受的背景下，深入研究EGFR信号通路的作用具有重要的科学意义和临床价值。
为了阐明EGFR信号在口腔癌疼痛和吗啡耐受中的作用，研究人员开展了一系列深入的实验。本研究发表在《Science Signaling》杂志上。研究团队综合运用了细胞培养、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光染色(IF)、蛋白质印迹(Western blot)、RNAscope原位杂交、钙成像、离体脑片膜片钳 electrophysiology 以及多种动物行为学测试等关键技术方法。研究中使用了人源（HSC-3, KCCT-781, DOK）和小鼠源（MOC2）口腔癌细胞系、人施万细胞(SCs)以及来自患者和小鼠的肿瘤组织样本。动物模型方面，采用了小鼠舌原位接种MOC2细胞的口腔癌模型。
EGFR ligands are dysregulated in the OSCC tumor microenvironment
研究人员首先关注了肿瘤微环境中的EGFR配体。他们发现，两种主要的EGFR配体——HB-EGF和TGFα——在人和小鼠OSCC细胞系中均有分泌，但其表达模式具有细胞系特异性。例如，KCCT细胞分泌更高水平的TGFα，而HSC-3细胞则分泌更多的HB-EGF。更重要的是，当与OSCC细胞非接触共培养后，原本分泌低水平配体的人施万细胞也被诱导产生更多的HB-EGF和TGFα。在OSCC患者肿瘤组织中，HB-EGF水平显著高于对侧正常组织，而TGFα则无显著差异。相反，在小鼠MOC2舌癌模型中，肿瘤组织表现出TGFα水平的升高，而HB-EGF无变化。这些结果表明，肿瘤微环境中特定的EGFR配体表达高度依赖于细胞系和具体背景。
EGFR is overexpressed in human nerves adjacent to OSCC and in TGs of cancer mice
接下来，研究团队检测了EGFR在神经组织中的表达。在OSCC患者切除的肿瘤样本中，他们发现存在神经周围浸润(PNI)的病例中，神经区域（GFAP阴性区）的EGFR表达显著高于无PNI的病例，而施万细胞（GFAP阳性区）的EGFR表达则无差异，提示EGFR主要在神经元中表达增加。在正常小鼠的三叉神经节(TG)中，EGFR在约69.7%的NeuN阳性神经元中表达。在携带MOC2舌癌的小鼠中，表达Egfr mRNA的TG神经元比例从假手术组的55.5%增加到肿瘤组的77.8%。这证实了EGFR在口腔癌相关的神经组织中存在过表达。
TGFα induces mechanical allodynia and calcium influx in TG neurons
为了验证EGFR配体的功能性作用，研究人员向小鼠口面部注射TGFα，发现其能剂量依赖性地降低机械痛阈（即诱发机械性痛觉超敏），且无性别差异。这种效应可被EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478和吉非替尼(gefitinib)所逆转。在分离培养的小鼠TG神经元中，TGFα刺激能诱发钙离子内流，而AG1478预处理能以时间依赖的方式降低TGFα引起的钙响应峰值和响应神经元的比例。这表明TGFα能直接作用于TG神经元，调节其兴奋性并诱发伤害性感受。
Suppressing EGFR signaling reduces oral cancer pain and calcium influx induced by oral cancer supernatant
在MOC2舌癌小鼠模型中，肿瘤小鼠表现出面部机械痛觉超敏。从接种后第7天开始给予AG1478治疗，能显著提高痛阈，缓解疼痛行为，且不影响肿瘤体积。在细胞水平，AG1478预处理能显著降低人HSC-3细胞和小鼠MOC2细胞上清液所诱导的TG神经元钙内流和响应细胞比例。这进一步证明EGFR抑制剂可以通过直接作用于神经元来抑制伤害性信号传导。
EGFR ligands HB-EGF and TGFα reduce, whereas EGFR inhibitors improve, morphine analgesia efficacy
研究团队随后探讨了EGFR在吗啡耐受中的作用。在正常小鼠中，连续注射吗啡（10 mg/kg/天）会在第4天产生镇痛耐受。若同时注射EGFR配体HB-EGF或TGFα，则会加速耐受的形成，使镇痛效果更早消失。相反，若同时注射EGFR抑制剂AG1478，则能显著延缓耐受的发生。在MOC2舌癌小鼠模型中，肿瘤小鼠对吗啡的镇痛反应更差（表现为耐受发展更快）。AG1478联合治疗能显著提高吗啡治疗组小鼠的机械痛阈，表明其能减轻吗啡耐受。这些结果在正常和荷瘤小鼠模型中均表明，EGFR激活会促进而EGFR抑制会减轻阿片类镇痛药的耐受。
Glutamate release, NMDARs, and PKC proteins are increased in the TGs and brainstems of OSCC mice
鉴于NMDAR在疼痛信号放大和阿片耐受中的核心作用，研究人员检测了其在三叉神经系统中的表达。蛋白质印迹分析显示，口腔癌小鼠的TG和脑干组织中NMDAR的必需亚基GluN1蛋白水平均升高。ELISA检测发现，HB-EGF或TGFα刺激能增加培养的TG神经元释放谷氨酸。同时，TGFα还能上调TG神经元中蛋白激酶C(PKC)的表达。在荷瘤小鼠的TG和脑干组织中，PKC蛋白水平也升高，且EGFR阻断剂AG1478能降低TG中的PKC表达。此外，广谱PKC抑制剂AEB071能显著减轻TGFα诱导的机械痛觉超敏。这些结果提示，EGFR激活可能通过上调PKC和NMDAR参与疼痛和耐受。
EGFR physically interacts with NMDARs and phosphorylates NMDARs upon activation by TGFα
为了探究EGFR如何影响NMDAR功能，研究人员检测了二者是否存在物理相互作用。共聚焦显微镜和邻近连接 assay(PLA)结果显示，在培养的小鼠TG神经元中，EGFR与NMDAR的GluN2B亚基存在共定位和近距离相互作用。更重要的是，TGFα刺激能诱导GluN2B亚基的磷酸化，而这一效应可被AG1478所抑制。这表明EGFR激活可以直接磷酸化NMDAR，从而可能调节其功能。
EGFR stimulation increases presynaptic NMDAR activity of SG neurons at the TNc
为了在突触水平研究EGFR的作用，研究人员在离体脑干切片上记录了三叉神经尾侧亚核(TNc)中胶状质(SG)神经元的微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)。发现HB-EGF或TGFα预处理30分钟能显著增加mEPSCs的频率（反映突触前谷氨酸释放概率），而不影响其幅度（反映突触后受体敏感性）。这种频率的增加可被NMDAR拮抗剂AP5所逆转，表明EGFR激活增强了突触前NMDAR的活性。
EGFR stimulation increases NMDAR activity at primary afferent central terminals that form synapses with SG neurons at the TNc
通过电刺激TNc背外侧缘（包含初级传入神经末梢）并记录SG神经元的单突触诱发EPSCs，研究人员进一步证实了上述发现。HB-EGF或TGFα处理使诱发EPSCs的基线幅度显著增大，且可被AP5逆转。同时，配对脉冲比率(PPR)降低，表明突触前释放概率增加。AP5应用后PPR升高，进一步支持EGFR激活增强了初级传入末梢突触前NMDAR的功能。
EGFR stimulation augments postsynaptic NMDAR activity of brainstem SG neurons
除了突触前效应，研究人员还通过直接向记录的SG神经元喷射NMDA来评估突触后NMDAR电流。发现HB-EGF或TGFα处理能显著增大喷射NMDA所诱发的电流幅度，表明EGFR激活也增强了突触后NMDAR的活性。
EGFR inhibition reverses presynaptic NMDAR hyperactivity in brainstem SG neurons caused by prolonged treatment with morphine
在连续7天给予吗啡处理的小鼠中，其TNc脑片SG神经元的mEPSCs频率显著增加，且可被AP5逆转。若在记录前将脑片与AG1478共孵育，则可显著降低由慢性吗啡处理引起的mEPSCs频率增高。
EGFR inhibition abrogates morphine treatment–induced increases in the activity of presynaptic NMDARs at primary afferent central terminals that form synapses with brainstem SG neurons
类似地，慢性吗啡处理增加了诱发单突触EPSCs的幅度并降低了PPR，这些效应均可被AP5逆转。AG1478预处理能抑制吗啡引起的这些突触前NMDAR功能亢进的变化。
EGFR inhibition normalizes morphine treatment–induced postsynaptic NMDAR hyperactivity of brainstem SG neurons
与之前在脊髓水平的研究结果不同，本研究发现慢性吗啡处理也导致了TNc区SG神经元突触后NMDAR电流的增强。AG1478处理能显著降低这种突触后NMDAR功能亢进。这表明在脑干水平，阿片类药物通过EGFR信号通路同时影响了突触前和突触后的NMDAR功能。
综上所述，本研究揭示了EGFR信号在口腔癌疼痛和吗啡耐受中的核心作用。口腔癌微环境中富含的EGFR配体（如HB-EGF和TGFα）导致三叉神经元EGFR激活和表达上调，进而通过增加钙内流、上调PKC、直接与NMDAR相互作用并磷酸化其GluN2B亚基，最终增强TNc区突触前谷氨酸释放和突触后NMDAR活性。这一系列事件共同促进了疼痛信号的放大和阿片镇痛效能的下降。EGFR抑制剂能够逆转这些病理变化，缓解疼痛并恢复吗啡疗效。该研究不仅深化了对口腔癌疼痛和 opioid 耐受机制的理解，更重要的是为临床转化提供了新的思路：即重新利用已获批的EGFR靶向抗癌药物来管理癌症疼痛和减少阿片类药物耐受，有望改善OSCC患者的疼痛管理质量和生活质量。
