《Biochemical Engineering Journal》：Genetically Encoded FRET-Based Sensor for Intracellular Heparin Monitoring in Real Time
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肝素是一种关键抗凝血药物，但传统检测方法存在灵敏度低、步骤繁琐等问题。本研究开发出基于FRET的基因编码纳米传感器HepSen，通过PF4蛋白与肝素的特异性结合实现高灵敏度（Kd=2.73×10??M）和宽范围（1nM-50μM）检测，可在大肠杆菌、酵母和HEK-293T细胞中稳定表达并实时监测肝素水平，有效解决临床肝素过量化验难题。
Sana Masroor|Neha Soleja|Mohamad Aman Jairajpuri|Mohd Mohsin
印度新德里贾米亚米利亚伊斯兰大学生物科学系
摘要
肝素是一种不可或缺的抗凝剂，在需要体外血液循环的外科手术中常用，包括心肺旁路手术。然而，肝素过量使用常常会导致潜在的致命出血并发症。因此，精确监测肝素水平对于避免肝素诱导的血小板减少症（HIT）和出血等风险至关重要。最近，已经设计出多种肝素检测工具，但这些工具操作复杂、灵敏度低，且无法实现实时监测。为此，我们开发了一种基于基因编码的荧光共振能量转移（FRET）技术的肝素传感器（HepSen），能够以高时空分辨率实现肝素的实时监测。HepSen通过在ECFP的N端和C端分别插入肝素结合蛋白——血小板因子4（PF4），从而实现了这一功能。这种新型纳米传感器在生理pH值下具有高稳定性，并且不受生物活性金属离子的影响。此外，还设计了两种突变体C12G和R20A；然而，野生型HepSen的结合亲和力最高，Kd值为2.73×10^-7 M，检测范围为1 nM-50 μM。HepSen在大肠杆菌（E. coli）、酿酒酵母（S. cerevisiae）和人胚肾细胞（HEK-293T）中表现出良好的表达能力，能够通过明确的饱和曲线实现肝素的实时监测，证明了其在多种生物系统中的传感能力。
引言
肝素是一种糖胺聚糖（GAG），通过与血液凝固机制中的关键蛋白质相互作用而作为重要的临床抗凝剂。它由1-4个吡喃糖基葡萄糖醛酸单元和2-氨基-2-脱氧葡萄糖吡喃糖单元组成。这种线性、高度硫酸化的多糖带有负电荷，可以结合阳离子蛋白质。在正常情况下，肝素参与多种生理和病理过程，如细胞生长、黏附、增殖和炎症。多年来，肝素被广泛用作抗凝剂，具有多种适应症和剂量。肝素通过与内源性凝血酶抑制剂（如属于丝氨酸蛋白酶超家族的抗凝血酶AT）结合，干扰血液凝固的正常进程。这种AT-肝素复合物的形成显著加速了抗凝血酶与凝血酶的反应，最终阻止纤维蛋白的形成并抑制血液凝固[1]。该药物广泛应用于各种医疗情况下的血栓预防或治疗，如心血管和骨科手术，以及与急性冠状动脉综合征、静脉血栓栓塞、心房颤动、外周阻塞性疾病和体外循环相关的侵入性操作[2]。临床推荐的肝素剂量为心血管手术期间2.0–8.0 U/ml，术后和长期维持期间0.2–1.2 U/ml[3]。不当使用可能导致不良副作用，包括肝素诱导的血小板减少症（HIT）、出血和骨质疏松症。肝素诱导的血小板减少症（HIT）是肝素治疗中最严重的并发症，由肝素给药后产生的抗体导致血小板活化引起。血小板因子4（PF4）是一种CXC趋化因子和肝素结合蛋白，会直接干扰抗凝血酶与因子Xa的结合，从而抑制AT依赖的反应。PF4与肝素的相互作用形成PF4-肝素复合物，随后通过产生抗PF4-肝素抗体和IgG免疫复合物触发免疫反应，最终导致血小板通过FccIIa受体活化并聚集，分泌促凝性血小板衍生微粒，进而导致血小板消耗和血小板减少。身体可能失去对抗过度出血的能力，迅速发生危及生命的失血[4]。
糖胺聚糖（GAGs）可以保护泌尿道的迁移上皮细胞免受病原体和致癌物质的黏附，有助于区分不同疾病的检测。尽管肝素也存在于细胞表面或细胞外基质中，但尿液中排出的大部分肝素是由GAGs分解产生的，其水平与感染、膀胱肿瘤和其他疾病的存在相关。鉴于上述临床应用，需要监测肝素水平，无论是用于手术过程中的给药还是抗凝治疗，还是用于肿瘤和感染等疾病的诊断[5]。由于过去四十年来肝素在治疗中的重要性和每年超过五亿剂量的广泛应用，已经进行了大量研究以开发能够直接检测生物样本中肝素的传感工具。
许多研究人员使用传统技术来检测血液或血清中的肝素水平，包括活化 clotting 时间（ACT）、活化部分凝血活酶时间（aPTT）、抗因子Xa测定、电化学方法和离子交换色谱法。在HIT的情况下，还通过免疫组化测定检测HIT抗体，作为一种间接的肝素检测方法。尽管这些方法已经成熟，但仍然存在一些固有的缺陷，如间接估计和缺乏精确度。此外，这些酶促测定的样品准备需要多步骤程序[2]。研究人员还通过在传感器分子中引入静电和氢键相互作用来开发基于荧光的肝素传感器。传感机制依赖于传感器分子与肝素相互作用时的构象变化。荧光团如AIEgen（聚集诱导发射）和芘衍生物在肝素荧光传感器的设计中显示出巨大潜力。然而，阐明肝素与传感器复合物之间的静电和氢键相互作用仍然具有挑战性，因为这些系统通常不适用于活细胞中的实时监测[5]。此外，还开发了多种其他用于肝素检测的荧光探针，包括小分子荧光探针[6]、[7]、结合聚合物[8]、[9]、荧光标记的生物分子[10]、肝素特异性肽[11]和量子点[12]。这些方法大多基于荧光淬灭（关闭型），但由于易受环境波动影响、灵敏度低、检测限差、多步骤程序和耗时协议而不够理想。
鉴于肝素检测的临床重要性以及现有检测技术的局限性，一种高效的肝素传感工具必须快速、简便、经济、高灵敏度和选择性强。为了解决这些问题，我们开发了一种基于基因编码的FRET传感器，能够在活细胞中检测和实时监测肝素。FRET是一种非辐射能量转移现象，发生在两个光谱重叠的荧光团之间；供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱重叠。FRET传感器由一个配体结合蛋白组成，该蛋白的N端和C端分别连接着供体和受体荧光团。配体与传感器蛋白的识别域结合会改变其构象，从而改变荧光团的相对取向，进而改变FRET信号。FRET信号测量可以检测活细胞内目标生物分子的浓度。基因编码的FRET传感器在单细胞水平上具有高特异性、灵敏度和高时空分辨率。这些传感器是非侵入性的，对细胞环境无毒，无需耗时的样品准备[13]、[14]。研究表明，FRET传感器已广泛用于不同的荧光应用，包括临床诊断、药物发现、光学成像以及葡萄糖、乳酸、三磷酸腺苷、丙酮酸等生物分子的检测及其在活细胞条件下的变化[15]、[16]、[17]。基于FRET的基因编码纳米传感器为活细胞中代谢物和生物分子的实时监测提供了可靠且强大的方法。这种纳米传感器的一个显著特点是它可以在多种细胞类型中表达。该纳米传感器在酵母中的高效表达以及成功的实时肝素监测证明了其生物学潜力。这种传感器技术易于使用，非常适合分析生物技术生产菌株和开发新的高通量筛选方法。
纳米传感器的设计与构建
使用京都基因与基因组百科全书（KEGG；www.genome.jp/kegg/）数据库，从人肺组织中鉴定出PF4蛋白作为配体结合域，用于构建基于FRET的肝素纳米传感器。PF4蛋白的晶体结构（PDB ID-1RHP）来自RCSB蛋白质数据库（PDB），其氨基酸序列从KEGG数据库中获取。通过分子对接研究了PF4蛋白的相互作用模式
分子对接
从RCSB-PDB获取了人PF4（1RHP-Mono）的晶体结构，并用于分子对接研究。使用AutoDock 4.2将化合物（配体）肝素与目标蛋白PF4进行对接。观察到结合亲和力为-4.7 kcal/mol，扭转能为9.65 Kcal/mol，并与目标蛋白的Lys14、Lys50、Gln9、Thr16和Cys52氨基酸残基发生氢键相互作用（图1A-D）。肝素还与Gln18发生了多个范德华相互作用
结论
在这项研究中，我们开发并表征了一种基因编码的荧光纳米传感器，用于检测细胞内的肝素水平。与之前用于肝素定量的传统方法相比，该方法更灵敏、更具选择性、成本更低且非侵入性。在体外和体内条件下进行的研究表明，HepSen对不同浓度的肝素有特异性反应。还生成了亲和力突变体
作者贡献
SM和MM设计了研究并起草了原始手稿。SM、NS和MM进行了所有体外实验。SM和MM进行了酵母和HEK细胞的活细胞成像。SM、MAJ和MM分析了数据。所有作者都阅读并批准了最终手稿。
CRediT作者贡献声明
Mohsin Mohd：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，可视化，验证，监督，软件，资源，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。Mohamad Aman Jairajpuri：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，可视化，验证，监督，研究，正式分析。Neha Soleja：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，可视化，验证，方法学，数据
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
第一作者（SM）感谢科学技术部通过WISE博士奖学金（WISE scheme (DST/WISE-PhD/LS/2023/76) 提供的研究资助，以支持这项研究工作。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
