电化学酶生物传感技术揭示了不同Leishmania (Viannia) braziliensis亚群中GPI锚定金属蛋白酶的差异表达水平

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Electrochemical enzyme biosensing reveals differential abundance of GPI-anchored metalloprotease across Leishmania (Viannia) braziliensis subpopulations

本研究利用电化学生物传感器检测了Leishmania (Viannia) braziliensis Thor株及其亚种群（Thor03, Thor10, Thor22）的GPI锚定金属蛋白酶活性，发现不同亚种群对抑制剂o-phenanthroline的响应存在显著差异，其中Thor10亚种群的检测灵敏度最高（5μM），而轴心无细胞amastigotes的检测灵敏度可达1μM。该传感器为实时分析寄生虫酶功能及致病性提供了新方法。

　　

Fatemeh Farshchi|Geovane Dias-Lopes|Vitor Ennes-Vidal|Luzia Monteiro de Castro Cortes|Mohammad Hasanzadeh|Franklin Souza Silva|Carlos Roberto Alves

奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（Funda??o Oswaldo Cruz），奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所（Instituto Oswaldo Cruz），分子生物学与地方性疾病实验室（Laboratório de Biologia Molecular e Doen?as Endêmicas），巴西里约热内卢Manguinhos区Brasil大道4365号，邮编21040-900

摘要

Leishmania (Viannia) braziliensis Thor菌株包含Thor03、Thor10和Thor22三个亚群，它们在体外和体内的生物学特性及感染能力各不相同。本研究通过磷脂酶C处理后结合Zn²⁺亲和层析法，分析了Thor菌株及其亚群中的GPI锚定金属蛋白酶。采用基于丝印碳电极的电化学生物传感器和差分脉冲伏安法检测金属蛋白酶活性及其对邻菲啉抑制剂的反应性。发现前鞭毛体和无菌无鞭毛体对邻菲啉抑制剂的结合模式存在差异，从而能够区分这些分析物。Thor10前鞭毛体和无菌无鞭毛体的检测灵敏度最高，分别达到5 μM和1 μM。不同亚群中这些分析物的可检测浓度范围不同：前鞭毛体为1000 μM至5 μM（其中Thor10亚群的检测范围最广），无鞭毛体为1000 μM至1 μM（Thor和Thor10亚群的灵敏度最高）。这些差异表明不同亚群中的金属蛋白酶含量存在差异。该研究结果突显了电化学生物传感器作为检测Leishmania酶的敏感、特异性工具的潜力，为研究寄生虫表型中的酶功能和毒力提供了新的系统方法。

引言

利什曼病（Leishmaniases）是由Leishmania属寄生虫引起的传染病，主要通过沙蝇传播，感染脊椎动物（如狗、啮齿类和人类）。这种疾病具有漫长的进化史和历史背景，曾在全球范围内扩散，并在社会和环境不稳定条件下反复出现[1]。90%以上的病例发生在包括巴西、伊朗和阿富汗在内的13个国家。尽管经过一个多世纪的研究，利什曼病仍然是一个重大的全球健康威胁。这一现象不仅反映了生物学和临床上的挑战，也凸显了当前控制措施和公共卫生政策的局限性，尤其是在应对新出现的威胁方面[2]。利什曼病分为两种主要类型：皮肤利什曼病（CL）和内脏利什曼病（VL），其中皮肤利什曼病最为常见，每年约有130万例[3]。在巴西等南美国家，Leishmania (Viannia) braziliensis是导致皮肤利什曼病、黏膜皮肤利什曼病（MCL）和播散性利什曼病（DL）的病原体[4]、[5]。作为一种重要的公共卫生问题，这些类型的治疗难度大、费用高昂，目前主要依赖五价锑剂作为一线疗法[6]。

L. (V.) braziliensis引起的不同临床结果，以及其对治疗的耐药性和流行病学特征，与其遗传多样性密切相关[7]、[8]。这种遗传多样性表现为不同的亚群或克隆变异体，对寄生虫的致病性和适应性起着关键作用。实验证据表明，即使是一个L. (V.) braziliensis菌株也可能包含多个亚群，这些亚群在生长行为、感染性、免疫调节和蛋白酶表达方面存在可测量的差异[9]。这种生物学复杂性强调了开展针对菌株内多样性的靶向研究的重要性，以更好地理解其对治疗效果和疾病进展的影响。

L. (V.) braziliensis的一个典型亚群例子是Thor菌株（MCAN/BR/1998/R619），该菌株是从巴西里约热内卢的一处犬类病变中分离出来的。由于其独特的生物学和酶学特性，研究人员对其进行了广泛研究。通过细胞分选技术，将Thor菌株分离为16个亚群，每个亚群都表现出不同的生物学特征，这通过它们在小鼠巨噬细胞感染实验、细胞因子产生和蛋白酶基因表达中的表现得到证实[9]。这些亚群在体外具有稳定性，便于进行广泛的实验探索和扩增。

Thor亚群之间的生物学多样性凸显了L. (V.) braziliensis的复杂性及其与宿主的相互作用。这种多样性在寄生虫表面尤为明显，表面蛋白在介导寄生虫与宿主免疫细胞及真皮细胞外基质的相互作用中起着关键作用[10]。在表面相关蛋白中，糖基磷脂酰肌醇锚定金属蛋白酶（GPI锚定金属蛋白酶）是Leishmania属中的主要毒力因子[13]。这类酶具有保守的结构特征，通常包含N端信号肽、调节性前结构域、锌依赖性催化结构域和C端GPI锚定信号，后者负责与膜结合[11]。这种结构使得酶在寄生虫表面稳定定位，并能直接与宿主底物相互作用。含锌的催化结构域负责催化活性，而GPI锚定结构则促进酶与细胞外基质成分和宿主免疫因子的接触[12]、[13]。因此，GPI锚定金属蛋白酶的结构-功能关系对其入侵宿主、逃避免疫系统和致病性至关重要[14]、[15]、[16]、[17]。研究表明，这些酶参与寄生虫生命周期的多个阶段，包括侵入宿主组织、降解细胞外基质和调节宿主免疫反应[18]、[19]。因此，针对金属蛋白酶可能有助于显著干扰疾病进程[20]。

在这种背景下，生物传感器能够基于寄生虫的生物分子，以高灵敏度和特异性检测和分析被忽视的热带疾病（NTDs）的病原体，如Leishmania属寄生虫[21]。其中，电化学生物传感器因能将生物相互作用转化为可测量的电信号而受到关注[22]。这类传感器通常由固定在电极表面的生物识别元件（如酶、抗体或核酸）组成，可选择性识别目标分子。与需要目标扩增、标记步骤或序列特异性探针的核酸基生物传感方法不同，酶类生物传感器可以直接检测蛋白酶，从而提供关于寄生虫存活能力和功能表型的信息，而不仅仅是遗传存在[23]、[24]。与依赖抗体稳定性和高度特异性抗原-抗体相互作用的免疫传感器相比，酶类生物传感器具有更强的鲁棒性、更低的生物降解风险、对脆弱生物试剂的依赖性更低，并具有潜在的成本优势[25]、[26]。此外，酶类生物传感器支持实时无标记监测，并可轻松用于基于活性的抑制剂筛选，为诊断应用和抗利什曼病药物发现提供功能性和转化优势[27]。

电化学（EC）生物传感器因其高灵敏度、快速响应时间和与复杂生物样本的兼容性，特别适合酶学研究和生物医学应用[21]。它们能够实时监测酶活性，即使在低浓度下也能定量分析分析物，这对于检测低丰度的生物标志物（如寄生虫蛋白酶）至关重要。此外，它们适应多种转换机制（安培法、电位法和阻抗法），增强了其在生物医学诊断中的多功能性。先前的研究已证明电化学生物传感器在检测Plasmodium falciparum中的乳酸脱氢酶等酶方面的成功应用，凸显了其在寄生虫学研究中的潜力[28]。然而，针对L. (V.) braziliensis蛋白酶的研究仍较为有限，因此探索这一方法具有新颖性和重要性。在此背景下，电化学生物传感器通过利用电极界面上的生物分子相互作用，提供了快速、低成本和现场检测方法[29]。它们在L. (V.) braziliensis蛋白酶研究中的应用为识别该寄生虫的关键毒力因子提供了有前景的途径。

本研究重点关注Thor03、Thor10和Thor22亚群，探讨了膜结合蛋白酶的酶活性，特别是GPI锚定金属蛋白酶在区分这些具有不同感染特征的寄生虫方面的潜力。总体而言，这些数据证明了基于丝印碳电极（SPCEs）的电化学生物传感器在分析Thor菌株亚群中的金属蛋白酶方面的潜力。了解这些酶成分对于揭示Leishmania属寄生虫在宿主体内的持久性及识别潜在表型标志物至关重要。此外，这种方法为研究Leishmania属中的蛋白酶提供了新的定量视角。

本研究采用综合方法，结合生化分析和电化学生物传感器来评估L. (V.) braziliensis Thor菌株及其亚群中的金属蛋白酶。选择o-菲啉作为参考抑制剂，因为它具有成熟的金属螯合活性，能选择性靶向Zn²⁺依赖性金属蛋白酶。同时使用特异性金属蛋白酶底物以确保功能特异性和酶活性的灵敏检测。基于SPCE的生物传感器策略依赖于金属蛋白酶与特定抑制剂的结合，旨在定量分析这些酶的丰度，作为潜在的表型标志物。这些发现有助于推进测量酶-抑制剂相互作用的生物传感技术，并加深对Leishmania毒力分子机制的理解。

化学试剂、培养基和材料

用于基质金属蛋白酶的荧光底物（7-甲氧基香豆素-4-乙酰-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DNP-Dpa-Ala-Arg-NH₂）、基质金属蛋白酶底物（MMP）、蛋白酶抑制剂（trans-环氧琥珀酰-l-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷（E-64）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和1,10-菲啉（o-phe）、6,7-二甲基-9-(d-1-核糖基)-异阿洛嗪（Riboflavin）、B型III型磷脂酶（PLC）、ProteoSilver? Plus银染色试剂盒、戊二醛（GA）和Schneider试剂

Thor菌株及其亚群的GPI锚定金属蛋白酶特征

在本研究的第一步中，分析了Thor菌株及其亚群（Thor03、Thor10和Thor22）的前鞭毛体和无菌无鞭毛体中的GPI锚定金属蛋白酶特征。需要注意的是，这种纯化方法得到的是富含金属蛋白酶的膜组分，而非单一纯化的GPI锚定金属蛋白酶。

讨论

利什曼病主要影响弱势群体，造成严重的健康损害，并带来深远的社会和经济影响，导致高发病率和死亡率[42]。Leishmania属的种群结构复杂性可能是造成这一现象的原因，因为它会影响寄生虫的适应性和利什曼病的致病性，从而增加治疗的难度，进而影响疾病的控制

结论

本研究开发了一种创新的酶类生物传感器，用于评估L. (V.) braziliensis Thor菌株及其亚群（Thor03、Thor10和Thor22）表面的GPI锚定金属蛋白酶。该电化学生物传感器能够特异性检测目标酶与来自细胞外基质金属蛋白酶的底物及选择性抑制剂o-菲啉的相互作用。该平台的检测限为1 μM

CRediT作者贡献声明

Fatemeh Farshchi：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析。Geovane Dias-Lopes：撰写 – 审稿与编辑、数据分析。Vitor Ennes-Vidal：撰写 – 审稿与编辑、数据分析。Luzia Monteiro de Castro Cortes：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计。Mohammad Hasanzadeh：撰写 – 审稿与编辑。Franklin Souza Silva：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、研究构思。Carlos Roberto Alves：撰写 –

资助

本研究部分由巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil，CNPq）（项目编号：305287/2023-0）、里约热内卢州卡洛斯·查加斯研究资助基金会（Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro，项目编号：E-26/010.000983/2019、E-26/204.189/2021、E-26/200.799/2021、E-26/210.114/2023、E-26/202.257/2024、E-26/210.976/2024）以及巴西高等教育人员培训协调委员会（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior，CAPES，项目编号：001）资助。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。