《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer》：SAG/RBX2/ROC2/RNF7 dual E3 ligase: From target identification, validation to drug discovery
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本文综述了SAG基因的双重功能：抗氧化作用及作为E3泛素连接酶调控的neddylation通路，其过表达与多种癌症患者不良预后相关，并探讨靶向该通路的小分子抑制剂和PROTAC降解剂的研究进展。
青宇|张世珍|李志坚|梁婷|孙毅
SunnyInnovation（杭州）生物制药有限公司，中国杭州310030
摘要
SAG（对凋亡敏感基因），也称为RBX2/ROC2/RNF7，最初被克隆为一个受氧化还原诱导的基因，编码一种富含半胱氨酸的抗氧化蛋白。后来研究发现，SAG属于RBX家族的第二个成员，具有RING结构域，对于E3连接酶在泛素化和neddylation过程中的活性至关重要。过去26年的研究数据显示，SAG在多种人类癌组织中过度表达，且与患者生存率较低呈正相关。功能研究表明，SAG对癌细胞生长以及由癌基因激活和肿瘤抑制因子失活引起的肿瘤发生过程至关重要。从机制上讲，SAG作为CRL5和CRL1的催化亚基，主要参与肿瘤抑制因子的泛素化及降解；当SAG被敲低或敲除时，这些肿瘤抑制因子会积累，从而抑制癌细胞的生长和存活，延缓肿瘤进展。因此，SAG E3正成为一种有吸引力的抗癌靶点，目前正在进行小分子抑制剂和PROTAC降解剂的药物发现研究。本文全面回顾了SAG的相关研究，涵盖了其分子克隆、生化特性、生物学功能、作为抗癌靶点的验证，以及针对SAG的药物发现进展。同时，也对SAG相关neddylation-CRLs的研究现状和未来方向提出了展望。
引言
SAG（对凋亡敏感基因）因其能被诱导凋亡的氧化还原剂激活并具有抗凋亡活性而被首次克隆[1]。后续研究证实，SAG也是一种E3泛素连接酶[2][3]。2013年，我们发表了关于SAG的综述[4]，总结了当时已知的其生化特性和生物学功能。在过去13年里，全球研究人员的共同努力下，SAG的研究取得了显著进展，包括确定了其与Cullin-5复合物的晶体结构[5]，进一步阐明了其在多种人类癌细胞生长和存活中的关键作用，并通过多种基因修饰小鼠模型证实了其在肿瘤发生中的促进作用，从而进一步验证了SAG E3作为抗癌靶点的潜力。本文简要回顾了SAG的早期发现历程和功能特性，重点介绍了过去13年的研究进展。
基于早期研究发现p53受到氧化还原调控[6]，我们筛选了一组氧化还原化合物以激活p53，并鉴定出1,10-菲咯啉（OP）这种金属螯合剂作为强效的p53转录激活剂[7]。随后利用差异显示技术[8]，克隆了一个新的受氧化还原诱导的基因SAG（Sensitive to Apoptosis Gene），以及参与GSH合成的谷胱甘肽合成酶[9]，作为OP-p53诱导基因。
SAG是一种高度保守的蛋白质[10][11]，分布于细胞质、细胞核以及最近发现的线粒体中[1][12]。在人类中，SAG位于3号染色体3q22–24区域[13]，在小鼠中位于9号染色体上[14]。SAG由113个氨基酸组成，含有12个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸在氧化剂作用下会形成分子内和分子间的二硫键，从而清除活性氧（ROS）[1][10]（见图1A），在体外试管实验中抑制脂质过氧化[1]，在细胞培养条件下抑制ROS诱导的细胞凋亡[1][3][15]，以及在小鼠大脑[16]或大鼠心肌细胞[17]中的缺血-再灌注损伤[16]（更多细节见早期综述[4]）。
后续研究发现，SAG具有C3CH4或C3H2C3的RING指结构域，该结构域与两个锌原子以交叉排列的方式结合，使其在与SCF/CRL1 E3连接酶的其他组分复合物时发挥催化作用[2][13]（详见图1B）。SAG的抗凋亡活性也依赖于其RING结构[15]。基于细胞培养的研究表明，SAG表达可促进细胞进入S期[18]，而反义转染敲低SAG则能抑制癌细胞生长[19]。
自SAG作为抗氧化蛋白被克隆以来的26年里，其生化特性被确定为抗氧化蛋白和同时具有neddylation及泛素化功能的E3连接酶；生物学上，它被认定为促癌蛋白和有潜力的抗癌靶点。图2展示了SAG研究的重要里程碑事件（用红色框标出），表1列出了2013年后发表的部分重要研究（2013年之前的研究已包含在综述[4]中）。
章节摘录
SAG作为抗氧化蛋白
早期研究通过体外和体内模型证实SAG具有抗氧化活性[4]。此后，有研究进一步证明SAG的抗氧化作用是其抗凋亡功能的基础。在前列腺癌PC3细胞中，敲低SAG会增加细胞内ROS水平，使细胞对多柔比星和紫杉醇的凋亡作用更敏感；而硫醇抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以逆转这两种效应[20]。
SAG-CUL5 E3连接酶复合物的结构生物学机制
Cullin-RING连接酶（CRLs）结构的研究扩展了我们对泛素转移机制的理解。虽然早期的CUL1-RBX1复合物晶体学研究确立了cullin支架作为刚性对接平台的模型[42]，但最近利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）和氢-氘交换质谱（HDX-MS）的技术进展表明，SAG实际上处于一个高度动态的构象循环中。
SAG的上游调控因子、相互作用蛋白及其下游底物
SAG具有多种功能：单独作用时作为抗氧化蛋白，或作为cullin neddylation和泛素化的双重E3连接酶。其表达水平和活性受到上游调控因子和相互作用蛋白的精确调控，从而影响下游底物的降解，进而调节多种关键信号通路。图4和表2总结了SAG的这些相互作用蛋白。
SAG的生理功能
SAG是一种双重功能蛋白。作为抗氧化蛋白，它清除ROS以保护细胞免受氧化应激；更重要的是，作为CRL E3泛素连接酶的重要组成部分，它促进多种关键细胞底物的泛素化及随后的蛋白酶体降解，从而调控细胞周期进展、信号转导、应激反应和肿瘤发生等多种生物学过程[4][112]。
SAG在多种人类癌症中的过度表达与患者生存率较低相关
SAG已被证实是一种重要的促癌因子，在多种恶性肿瘤中经常发生失调，因此具有作为预后生物标志物和治疗靶点的巨大潜力[112]。临床研究一致显示，SAG在多种癌症中过度表达，包括乳腺癌[143]、结肠直肠癌[19][144]、子宫内膜/宫颈癌[145]、胃癌[104]、胶质母细胞瘤[146]、肾癌[147]、肝癌[148]、肺癌[149][150]、胰腺癌等。
阻断neddylation途径的当前研究进展
尽管针对SAG相关neddylation途径的抗癌研究备受关注（相关综述见[38][162]），但目前的临床开发仅限于两种neddylation E1的小分子抑制剂：MLN4924（pevonedistat）[158]和TAS4464[174]。这两种化合物均通过共价抑制NEDD8激活酶（NAE）来阻断整个neddylation级联反应[38]。
MLN4924（pevonedistat）是首个此类抑制剂。
争议、未解决的问题及未来展望
过去二十年里，对SAG的研究使其从一个单纯的抗凋亡蛋白转变为细胞稳态的核心调节因子，并成为临床研究中的新兴治疗靶点。它作为抗氧化剂和双重E3连接酶的复杂角色引发了诸多争议和未解决的问题。未来，几个关键研究领域有望深入揭示其机制。
致谢
本研究部分得到了国家自然科学基金（资助编号U22A20317和92253203，资助对象为YS）和国家重点研发计划（资助编号2022YFC3401500和2021YFA1101000，资助对象为YS）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
