《Bioelectrochemistry》：Silica-detoxified perovskite ECL: Cas13a-triggered signal-on sensing with CsPbBr?@SiO?@Au
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通过整合CsPbBr?@SiO?@Au纳米复合材料与CRISPR/Cas13a-Nb.BbvI递增放大系统，构建了具有优异水稳定性和低毒性的信号-on电化学发光（ECL）生物传感器，实现了ultrasonic miRNA检测灵敏度达1.86 aM。纳米结构设计（SiO?壳层增强稳定性/Au纳米颗粒提供锚定位点）与CRISPR递归放大（Cas13a切割触发Nb.BbvI循环回收探针）协同作用，确保了高特异性（区分同源序列）和线性范围广（1 aM-1×10? aM）。经血清验证，回收率95.22%-104.61%（RSD<5%），并成功区分患者与健康人群样本，为核酸液体活检提供新平台。
Kangqi Xie|Haozhen Ren|Dingpeng Ban|Luchang Chen|Xudong Xin|Jiayi Zhang|Qianli Tang|Longjian Huang|Jihua Wei|Kai Zhang|Xianjiu Liao
中国广西百色右江民族医学院附属医院，广西骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室，533000
摘要
钙钛矿纳米晶体是具有吸引力的电化学发光（ECL）发射体，但存在水稳定性差和潜在毒性的问题。本文报道了一种信号激活型电化学发光生物传感器，该传感器将CsPbBr?@SiO?@Au纳米复合材料与CRISPR/Cas13a–Nb.BbvCI扩增级联系统结合，用于超灵敏的microRNA检测。CsPbBr?核心提供明亮的发光，SiO?壳层增强了水相兼容性并抑制了离子泄漏，表面的Au纳米粒子为硫醇化的铁芬环（Fc-HP）提供了丰富的固定位点。在静止状态下，近端的Fc能够有效淬灭CsPbBr?的ECL信号。目标miRNA激活Cas13a，使其切割哑铃形探针并释放出能与Fc-HP杂交的中间片段；随后的Nb.BbvCI切割将Fc从电极上移除并实现循环利用，从而产生稳定的信号恢复。通过形态学（TEM）、成分分析（EDS/XPS）和阶梯式电化学（CV/EIS）验证了这种核壳-Au结构以及预期的淬灭→恢复行为。在优化条件下（0.5 mg/mL CsPbBr?@SiO?@Au、2.0 μM Fc-HP、40分钟目标孵育、100 mM TPrA、120秒预反应），该传感器的检测范围为1 aM–1.0 × 10^9 aM，检测限（LOD）为1.86 aM。该传感器对同源序列具有高特异性，在添加了miRNA的血清样本中可实现95.22%–104.61%的回收率，相对标准偏差（RSD）< 5%。初步实验表明该传感器能够区分患者血清样本和健康对照组，显示出临床应用潜力。这一模块化平台将稳定的钙钛矿ECL发射与可编程的CRISPR技术相结合，为microRNA分析提供了一种灵敏、选择性强且兼容水相的检测方法。
引言
电化学发光（ECL）生物传感作为一种灵敏且对设备要求低的核酸液体生物检测方法，因其低光学背景、高表面可控性和易于与酶促扩增结合而受到关注[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。金属卤化物钙钛矿，尤其是CsPbBr?纳米晶体，由于其高辐射效率和快速的电荷传输能力而成为优秀的ECL发射体[8]。然而，钙钛矿在生物介质中的应用长期受到其较差的水稳定性和Pb^2+泄漏安全问题的限制。通过将钙钛矿核心嵌入超薄、致密的SiO?壳层（CsPbBr?@SiO?）中，可以显著提高其水相兼容性：二氧化硅屏障抑制了离子迁移和表面陷阱态，减少了在潮湿或水环境中的溶解，并降低了Pb释放的风险[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。因此，这种复合材料在缓冲的生物检测环境中表现出更好的分散性和操作稳定性，使其作为可靠的ECL传感器使用，同时降低了相对于纯钙钛矿的毒性风险。
从功能上看，SiO?壳层还提供了一个化学惰性、生物相容性的界面，能够耐受电解质、蛋白质和核酸。在外表面涂覆Au纳米粒子（CsPbBr?@SiO?@Au）后，通过Au-硫醇化学作用形成了密集且定义明确的固定位点，从而实现了高产量的硫醇化DNA探针固定，而不会使发光核心失活。这种结构支持基于距离控制的ECL淬灭/恢复机制：组装在Au层上的铁芬环标记的发夹结构（Fc-HP）靠近发光体，能够在静止状态下淬灭ECL信号，从而设定一个较低的基线水平[14]、[15]。
CRISPR/Cas13a是一种针对RNA目标设计的互补分子工具。Cas13a是一种RNA引导的RNase，当目标RNA与其CRISPR RNA（crRNA）杂交时，它会从序列特异性的内切酶转变为一种强大的“旁路”核酸酶，无差别地切割附近的单链RNA[16]、[17]、[18]。这一特性使得无需逆转录或聚合酶即可实现“等温”的酶促信号放大，非常适合检测如miRNA这样的短生物标志物。实际应用中，crRNA间隔区（通常根据目标序列长度为24–28 nt）被设计为与目标区域完全互补，从而实现单核苷酸错配的区分；合成的富含rU的报告分子（或嵌入探针中的rU环段）可作为高效的旁路底物[19]、[20]、[21]。Cas13a在温和的Mg^2+缓冲液和接近生理温度的条件下运行，并且在使用RNase抑制剂和简单阻断策略的情况下能够耐受复杂的生物基质。当与切割内切酶结合使用时，目标激活的旁路切割可以转化为探针的循环利用，使每个目标RNA事件触发多次表面反应，从而大幅增强信号强度——这与ECL传感器的特性非常匹配，因为近端标记的去除直接恢复了钙钛矿的天然发光。
为了赋予分子特异性和信号增强效果，我们将CRISPR/Cas13a驱动的酶级联系统与哑铃形探针（DBP）和切割内切酶Nb.BbvCI结合。血清中的目标miRNA与Cas13a–crRNA复合物结合，激活Cas13a对DBP中富含rU的环段进行切割，破坏哑铃结构并释放DNA中间片段。该中间片段与表面结合的Fc-HP杂交形成Nb.BbvCI识别位点；随后Nb.BbvCI切割将Fc标记的片段从电极上移除，从而实现信号的恢复。重要的是，释放的中间片段会重新进入循环，持续处理更多的Fc-HP分子，实现目标的循环利用和显著信号放大。所提出的传感器结合了（i）适合生物介质的、低毒性的钙钛矿ECL平台（CsPbBr?@SiO?@Au）；（ii）Cas13a的可编程RNA识别和切割能力；以及（iii）通过切割辅助的循环利用机制，将单个miRNA事件转化为强烈的ECL信号。
化学物质和试剂
溴化铯（CsBr）、溴化铅（PbBr?）、1-十八烯（ODE）、油酸（OA）、油胺（OAm）、甲苯、己烷、乙醇、丙酮、环己烷和氢氧化铵（28–30%）均为分析级纯度（≥99%）。四乙基正硅酸盐（TEOS）、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTS）、四氯化金(III)三水合物（HAuCl?·3H?O）、柠檬酸钠、硼氢化钠（NaBH?）、6-巯基-1-己醇（MCH）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）等。所提出的ECL生物传感器原理
所提出的电化学发光（ECL）生物传感器的工作原理如图1所示。如图1A所示，首先通过用CsPbBr?@SiO?@Au纳米复合材料修饰玻璃碳电极（GCE）来制备传感界面。在这种结构中，CsPbBr?钙钛矿核心作为高效的发光体，SiO?壳层提高了水稳定性并降低了钙钛矿的固有毒性，表面的Au纳米粒子（AuNPs）进一步增强了传感性能。结论
我们建立了一种信号激活型电化学发光生物传感策略，该策略将水稳定性高、低毒性的CsPbBr?@SiO?@Au纳米复合材料与CRISPR/Cas13a旁路切割和Nb.BbvCI辅助循环利用相结合。SiO?壳层显著提高了钙钛矿发光体的水相稳定性，并降低了其固有的毒性；Au表面为硫醇化发夹探针提供了稳定的固定位点，实现了高效的淬灭→恢复信号转导。
CRediT作者贡献声明
Kangqi Xie：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、项目监督、软件开发、方法学设计、数据分析。Haozhen Ren：验证实验、软件开发、项目管理、方法学设计、数据分析。Dingpeng Ban：数据可视化、结果验证、软件应用、资源协调、研究实施、资金获取、数据管理。Luchang Chen：结果验证、资源调配、项目管理、方法学设计、资金获取、数据分析。Xudong Xin：利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
我们衷心感谢以下机构的财政支持：国家自然科学基金（82260532）、广西自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、生命科学分析化学国家重点实验室（SKLACLS2314）、广西骨与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（21-220-06-202205）、百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-38-05）。
