《Nucleic Acids Research》：LDB1 regulates gene expression and chromatin structure in pluripotency and lineage differentiation
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本研究针对染色质组织结构在干细胞多能性和分化过程中的关键作用，探讨了增强子环路蛋白LDB1在胚胎干细胞中的未知功能。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建Ldb1基因敲除胚胎干细胞模型，发现LDB1缺失导致多能性因子SOX2和KLF4表达下调，并通过占据超级增强子区域调控Sox2基因的增强子-启动子相互作用。研究证实LDB1缺失会损害胚胎体形成和红细胞终末分化，同时引起Lin28-Let-7信号通路显著失调。这项研究揭示了LDB1在干细胞多能性维持和分化命运决定中的新机制，为理解染色质三维结构调控发育过程提供了重要见解。
在生命科学领域，干细胞的多能性维持和分化命运决定一直是研究的核心问题。胚胎干细胞（ESC）具有自我更新和分化为所有细胞类型的独特能力，这一过程受到精密调控的基因表达网络和染色质结构的严格控制。然而，在这个复杂的调控网络中，增强子环路蛋白LIM结构域结合蛋白1（LDB1）在干细胞中的具体功能尚不完全清楚。LDB1作为多蛋白复合物的核心组分，在红细胞等多种细胞类型中已被证明能够驱动增强子与靶基因之间的环路形成，从而激活基因表达。但在多能干细胞中，LDB1是否以及如何参与调控多能性维持和分化决策，仍然是一个待解的科学问题。
为了解决这一知识空白，研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了题为"LDB1 regulates gene expression and chromatin structure in pluripotency and lineage differentiation"的研究论文。该研究通过综合运用多种前沿技术手段，系统阐明了LDB1在胚胎干细胞生物学中的关键作用。
研究团队主要采用了以下几种关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ldb1基因敲除的胚胎干细胞系；通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术绘制LDB1在全基因组的结合位点；使用染色质构象捕获（3C）技术研究染色质三维结构；通过ATAC-seq分析染色质可及性变化；并建立条件性基因敲除小鼠模型进行体内功能验证。
LDB1缺失下调胚胎干细胞中的多能性因子
研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Ldb1(-/-)胚胎干细胞系。令人惊讶的是，虽然LDB1缺失的细胞在形态上与野生型细胞相似，但它们表现出碱性磷酸酶活性增强和EdU掺入增加，表明增殖能力增强。更重要的是，免疫荧光染色和蛋白质印迹分析显示，Ldb1(-/-)细胞中关键多能性因子SOX2、OCT4、NANOG和KLF4的蛋白水平显著降低。通过建立四环素诱导的LDB1表达系统，研究人员证实这些变化确实是由LDB1缺失直接引起的。
Ldb1(-/-)ESC中胚胎体形成和红细胞发育受损
当研究人员将Ldb1(-/-)胚胎干细胞分化为胚胎体（EB）时，发现虽然能够形成形态正常的胚胎体，但其尺寸明显小于野生型对照组。基因表达分析显示，代表三个胚层分化的标志物Gata1（外胚层）、Brachyury（中胚层）和Gata-4（内胚层）表达均显著降低，表明Ldb1(-/-)胚胎体的分化潜能受损。进一步将胚胎体诱导分化为红细胞时，Ldb1(-/-)细胞表现出TER119和CD71阳性细胞比例显著减少，β-球蛋白表达降低，以及红细胞成熟受阻。
Ldb1(-/-)胚胎干细胞和胚胎体中的差异基因表达
转录组分析揭示了LDB1缺失对基因表达的深远影响。在胚胎干细胞阶段，有1898个基因表达发生改变（515个下调，1383个上调）；在胚胎体阶段，有829个基因表达异常（322个下调，507个上调）。基因集富集分析（GSEA）显示，LDB1缺失影响了干细胞分裂相关基因的表达。特别值得注意的是，包括NODAL、WNT和LIN28信号通路在内的多个关键发育通路都受到了显著影响。
Ldb1缺失导致Lin28介导的干细胞自我更新活性失调
深入研究显示，Ldb1(-/-)胚胎干细胞中Lin28a和Lin28b的表达显著上调，同时其靶标miR-Let7a表达下降，导致HMGA2蛋白水平升高。这一发现特别重要，因为LIN28-Let-7通路在干细胞自我更新和分化中起着关键调节作用。通过可诱导的LDB1重新表达实验，研究人员证实了LDB1对LIN28b表达的直接调控作用。
LDB1在发育过程中增强子功能的作用
为了阐明LDB1调控基因表达的分子机制，研究人员进行了LDB1 ChIP-seq分析，发现LDB1在胚胎干细胞中主要结合在基因间区和内含子区域（占84%），这与增强子的定位特征一致。更重要的是，LDB1显著富集在超级增强子（SE）区域，且与30%的已知胚胎干细胞超级增强子重叠。Motif分析发现LDB1结合位点富含SOX2和KLF4等多能性因子的结合 motif，且LDB1与OCT4、SOX2和NANOG在504个位点存在共定位。
Ldb1(-/-)胚胎干细胞和胚胎体中全局染色质可及性丧失
ATAC-seq分析显示，LDB1缺失导致胚胎干细胞和胚胎体中染色质可及性全局性降低。在胚胎干细胞中，有39,624个可及性区域消失；在胚胎体阶段，这一数字增加到97,849个。差异可及性分析发现，这些变化主要发生在启动子区域（胚胎干细胞中占68%），且大多数区域（84%）的可及性在LDB1缺失后降低。
Ldb1缺失导致小鼠骨髓中Lin28信号失调
最后，研究人员利用条件性基因敲除小鼠模型（Mx-Cre; Ldb1flox/flox）验证了LDB1在体内的功能。与体外实验结果一致，Ldb1条件性敲除小鼠的骨髓细胞中LIN28b表达上调，miR-Let7表达下降，HMGA2表达升高。同时，造血干细胞标志物Sca-1+和CD117+的阳性细胞比例显著减少，表明LDB1对造血干细胞的维持至关重要。
综合以上研究结果，可以得出以下重要结论：LDB1通过与其他多能性因子（OCT4、SOX2、NANOG和KLF4）在超级增强子区域共定位，参与调控胚胎干细胞的关键基因表达网络。LDB1缺失不仅直接影响多能性因子的表达，还通过改变染色质三维结构和可及性，间接影响多个信号通路（包括LIN28-Let-7、NODAL和WNT通路）的活性。这些变化共同导致胚胎干细胞自我更新和分化潜能的失衡，最终影响正常的发育过程。
这项研究的创新之处在于首次系统揭示了LDB1在胚胎干细胞多能性维持和谱系分化中的核心作用，并阐明了其通过调控超级增强子环路的分子机制。这些发现不仅深化了我们对染色质结构调控发育过程的理解，也为干细胞生物学和再生医学研究提供了新的理论依据。由于增强子具有组织特异性和可调控性，针对LDB1相关增强子网络的干预可能为遗传性疾病和癌症的治疗提供新的策略。
