《Brain Research》：RhoA regulates morphine associated NMDA receptor signaling in the prelimbic region of medial prefrontal cortex pyramidal neurons
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本研究针对阿片依赖中前额叶皮层神经适应性改变机制不清的问题，通过行为学、分子生物学及电生理学技术，揭示了前边缘皮层（PLC）RhoA小G蛋白通过调控突触和突触外NMDA受体活性，介导吗啡诱导的条件性位置偏好和运动敏化的新机制。该发现为深入理解阿片成瘾的神经环路可塑性提供了新视角，并提示PLC区RhoA是潜在的干预靶点。
阿片类药物依赖是一个全球性的重大公共卫生问题，其核心特征之一是大脑奖赏环路，特别是内侧前额叶皮层（medial Prefrontal Cortex, mPFC）出现了病理性神经可塑性改变。尽管研究表明小G蛋白RhoA和NMDA受体（N-Methyl-D-Aspartate Receptor, NMDAR）在成瘾相关的突触可塑性中扮演重要角色，但它们在mPFC特定亚区——前边缘皮层（Prelimbic Cortex, PLC）内的具体相互作用机制，尤其是在阿片依赖背景下的作用，仍不清楚。这限制了我们开发更有效干预策略的能力。
为了回答这一问题，来自空军军医大学西京医院的研究团队在《Brain Research》上发表论文，深入探究了PLC区RhoA信号在吗啡诱导的神经适应和行为表现中的关键作用。研究人员发现，抑制PLC区的RhoA活性，能够显著减弱吗啡诱导的条件性位置偏好（Conditioned Place Preference, CPP）和运动敏化。在机制上，反复吗啡给药（Repeated Morphine Administration, RMA）上调了PLC第5层锥体神经元中RhoA的表达。利用电生理技术，他们进一步证明RhoA的抑制会降低由突触NMDAR介导的兴奋性突触后电流（Excitatory Postsynaptic Currents, EPSCs）的幅度。更有趣的是，通过使用活动依赖性的MK-801阻断方法来分离突触外成分，研究发现RhoA抑制还能显著减弱突触外NMDAR的激活，这可能是通过限制高频刺激时谷氨酸的“溢出”（spillover）来实现的。这些发现阐明了RhoA通过调控突触和突触外NMDAR活性来介导阿片诱导的神经适应的关键机制，确立了PLC区的RhoA作为阿片依赖的一个有前景的治疗靶点。
本研究综合运用了几项关键技术方法：通过立体定位注射技术对大鼠PLC脑区进行精准给药（RhoA抑制剂Rhosin）；采用经典的条件性位置偏好（CPP）和自发活动测试来评估吗啡的奖赏效应和运动行为改变；利用蛋白质免疫印迹（Western Blotting）和免疫荧光染色检测mPFC脑区内RhoA及NMDAR1（NR1）亚基的蛋白表达水平与细胞定位；并运用离体脑片全细胞膜片钳记录技术，在PLC第5层锥体神经元上记录由刺激第2/3层传入纤维所诱发的NMDAR电流，同时采用MK-801活动依赖性阻断法分离并研究突触外NMDAR的功能。
3.1. Rhosin对吗啡诱导的CPP和运动活动的影响
研究人员通过向大鼠PLC脑区微量注射RhoA抑制剂Rhosin，观察其对吗啡诱导的行为学改变的影响。结果表明，反复吗啡给药能成功建立CPP模型并引起运动敏化。而提前在PLC区注射Rhosin，则能有效阻断吗啡诱导的CPP形成和运动活动的增加。这说明，抑制PLC区的RhoA信号通路足以挽救吗啡引起的行为学变化。
3.2. 吗啡给药后PLC区RhoA的表达增加
通过Western Blotting和免疫荧光染色分析发现，与生理盐水对照组相比，反复吗啡给药后，大鼠mPFC脑区内RhoA的蛋白表达水平显著上调，而NMDAR1（NR1）亚基的表达未发生明显变化。免疫荧光双标结果进一步显示，在PLC第5层，与神经元核抗原（NeuN）共标的RhoA阳性神经元比例在吗啡组显著高于对照组。这表明反复吗啡暴露特异性地增强了PLC第5层锥体神经元中RhoA的表达。
3.3. RhoA信号通路降低NMDA受体活性
为了解RhoA如何影响NMDAR功能，研究者在离体脑片上记录了PLC第5层锥体神经元的NMDAR电流。结果显示，应用Rhosin后，由单脉冲刺激诱发的突触NMDAR-EPSCs的幅度显著降低，且在冲洗掉Rhosin后电流幅度得以恢复。随后，他们使用NMDAR开放通道阻滞剂MK-801进行活动依赖性阻断，先完全阻突触NMDAR。发现在此条件下，Rhosin的施加对剩余的被阻断的突触NMDAR电流无显著影响，证实了Rhosin确实影响了功能性的NMDAR活性。
3.4. RhoA抑制剂减少突触外NMDAR电流
为了探究RhoA对突触外NMDAR的作用，研究人员采用高频刺激（10个脉冲，50 Hz）来诱发谷氨酸溢出，从而激活位于突触外区的NMDAR。在先用MK-801完全阻突触NMDAR的前提下，这种高频刺激诱发的电流主要反映突触外NMDAR的活性。实验发现，在施加Rhosin后，这种MK-801抵抗的、由高频刺激诱发的NMDAR-EPSCs的幅度和电荷转移量均显著降低。这表明RhoA的抑制减少了高频刺激引起的谷氨酸溢出，从而限制了突触外NMDAR的募集和激活。
本研究结论部分总结道，PLC区RhoA信号通路在吗啡诱导的CPP和运动敏化中扮演着关键角色。其机制涉及RhoA对上调和调节PLC锥体神经元中NMDAR功能的重要性，包括对突触和突触外NMDAR活性的调控。讨论部分强调，该研究不仅揭示了RhoA在阿片依赖的mPFC神经可塑性中的新功能，还提出了一个由RhoA介导的、双向调控NMDAR功能以精确控制突触结构和受体运输的模型，这可能是一种重要的神经适应和保护机制。该发现为理解阿片成瘾的分子细胞机制提供了新的重要见解，并提示靶向PLC区的RhoA信号通路可能是治疗阿片依赖的潜在新策略。未来研究需要进一步阐明RhoA调控NMDAR的下游信号通路，以及在不同脑区特异性作用。
