《Computers and Electronics in Agriculture》：Study on diagnosis of subclinical mastitis and identification of pathogens using electronic nose detection of cow’s milk
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奶牛隐性乳腺炎早期诊断及病原菌鉴定研究中，采用电子鼻（e-Nose）结合GC-MS技术分析健康、隐性及临床乳腺炎奶牛的牛奶挥发性有机物（VOCs），通过随机森林（RF）和支撑向量机（SVM）算法实现91.7%-97.0%的准确率与特异性，并发现病原菌显著改变牛奶代谢组特征。
王芳|朱玉军|张恩秋|张荣|段宏伟|杨帅|杜向红|赵兴旭|马晓飞|张丽红|胡俊杰
甘肃农业大学兽医学院，中国甘肃省兰州市730070
摘要
亚临床乳腺炎会导致牛奶产量和质量的下降，以及牛奶成分的变化，从而给乳制品行业带来巨大的经济损失。因此，建立一种早期和快速的亚临床乳腺炎诊断方法对于预防和减少奶牛乳腺炎的发生至关重要。从20头健康奶牛、20头患有亚临床乳腺炎的奶牛和20头患有临床乳腺炎的奶牛的牛奶中随机选取了响应信号，确保每组都有均衡的代表。使用多元分类器分析了电子鼻（e-Nose）检测系统的响应信号。其次，通过细菌学分析和特定的聚合酶链反应（PCR）鉴定了感染单一细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或无乳链球菌）的亚临床乳腺炎奶牛的牛奶样本。结合气相色谱-质谱（GC–MS）的e-Nose检测系统用于分析亚临床乳腺炎奶牛牛奶样本中的这三种病原菌。
结果表明，基于牛奶样本，e-Nose在亚临床乳腺炎的诊断中是有效的；随机森林（RF）算法的准确率、灵敏度和特异性分别为91.7%、93.3%和97.0%。其次，支持向量机（SVM）算法使用e-Nose对这三种病原菌的准确率、特异性和灵敏度分别为83.3%、88.9%和91.7%。最后，GC–MS的结果显示，这三种病原菌显著影响了亚临床乳腺炎牛奶样本的代谢物谱型。研究结果表明，所建立的e-Nose系统能够有效捕获有关亚临床乳腺炎和不同病原菌的相关诊断信息。
引言
乳腺炎是影响乳品养殖最常见的疾病之一（Pinzón-Sánchez等人，2011年；Jamali等人，2018年）。它显著降低了奶牛的产奶量，并导致牛奶质量下降（Pecka-Kie?b等人，2016年；Cobirka等人，2020年；Carvalho等人，2019年）。该疾病的高发病率和广泛分布给乳品养殖行业造成了巨大的经济损失，严重限制了乳品养殖的发展（Ruegg，2025年；Santman-Berends等人，2016年）。在奶牛中，根据临床表现，乳腺炎可以分为临床乳腺炎奶牛和亚临床乳腺炎奶牛。患有临床乳腺炎的奶牛表现出明显的症状，而患有亚临床乳腺炎的奶牛则没有可见的变化，这使得诊断这种疾病变得困难（Pinedo等人，2011年；Bangar等人，2015年）。奶牛乳腺炎的病因复杂，可能由多种病原微生物引起（Kumari等人，2018年）。细菌感染是乳腺炎最常见的原因之一（Heikkil?等人，2018年）。在这些病原菌中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌通常被认为是乳腺炎的主要病原菌（Bhat等人，2017年；Elias等人，2020年；Srithanasuwan等人，2023年）。早期检测亚临床乳腺炎并鉴定病原菌、控制传染源和适当的治疗可以有效预防和减少该疾病的发生（Fonseca等人，2024年）。因此，准确诊断奶牛的亚临床乳腺炎并鉴定致病细菌对于乳腺炎的治疗和预防至关重要。
用于诊断奶牛亚临床乳腺炎的传统方法包括加州乳腺炎测试（Mahmmod等人，2013年）、牛奶体细胞计数（Schwarz等人，2011年）、牛奶pH值测试（Kandeel等人，2019年）和牛奶电导率测试（Anika等人，2023年）。然而，这些测试工作量大，需要人员接受检测技能培训。同样，传统的细菌鉴定方法通常包括病原菌的分离和培养、形态学评估以及特定的聚合酶链反应（PCR）。这些传统方法也有检测周期长的缺点。此外，红外热成像在检测亚临床乳腺炎区域方面相对敏感（Polat等人，2010年），但通过红外热成像进行目标提取存在问题。基于牛奶中牛奶淀粉样蛋白A（MAA）的检测来诊断亚临床乳腺炎与乳腺炎以外的因素无关（Hussein等人，2018年）。然而，缺乏标准化的水分浓度和体细胞计数（SCC）方法。最后，通过表面增强拉曼光谱（SERS）可以基于检测细菌挥发性有机化合物（VOCs）来鉴定和监测细菌（DeJong等人，2017年）。然而，便携式设备更适合满足牧场的需求。因此，找到一种快速、灵敏和可靠的检测奶牛乳腺炎病原菌的方法至关重要。
基于气体传感器阵列的电子鼻（e-Nose）在医疗和食品应用中得到广泛应用。将e-Nose应用于牛奶质量检测和细菌鉴定非常有用（Chen等人，2022年）。结合CO2传感器的气体金属氧化物传感器可以区分临床乳腺炎的乳腺和健康的乳腺（Lima等人，2018年）。使用e-Nose训练机器学习算法可以识别牛奶来源并估计牛奶中的脂肪和蛋白质含量（Mu等人，2020年）。这些先前的结果表明，e-Nose可以用于检测牛奶质量。此外，微生物在生长过程中会释放特定的挥发性化合物（?uchowska和Filipiak，2024年）。这些化合物可用于病原体鉴定。使用Cyranoose 320可以鉴定引起眼部感染的细菌，分类准确率达到96%（Dutta等人，2002年）。可以使用人工神经网络（ANN）对牛奶样本中的四种病原体进行分类（Hettinga等人，2008年）。这些结果表明，e-Nose可以作为准确检测细菌病原体和进行早期诊断筛查的工具。
本研究的目的是使用e-Nose诊断亚临床乳腺炎并鉴定三种致病细菌。还通过气相色谱-质谱（GC–MS）定性和定量分析了感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或无乳链球菌的牛奶样本中的代谢组特征挥发性化合物。我们的发现将为亚临床乳腺炎和不同病原体的诊断提供新的见解。
伦理声明
所有样本均按照标准样本采集程序收集，未对动物造成任何压力或伤害。实验程序得到了甘肃农业大学动物实验伦理审查委员会的批准（GAU-Eth-VMC-202-1-045）。
动物选择和牛奶样本采集
本研究采用横断面实验设计。2023年4月1日至5月10日，实验在甘肃省张掖市的一个农场进行。该农场有4590头澳大利亚荷斯坦泌乳奶牛
使用e-Nose对健康奶牛、亚临床乳腺炎奶牛和临床乳腺炎奶牛的牛奶样本进行差异分析
通过PCA和OPLS-DA分析三种类型牛奶样本的传感器响应值，我们可以清楚地区分健康奶牛、亚临床乳腺炎奶牛和临床乳腺炎奶牛的牛奶。主成分1和2的贡献分别为92.5%和2.2%，累积贡献为94.7%（图1A）。展示了OPLS-DA模型的质量参数结果（图1C）。因变量拟合指数（R2Y）= 0.857，模型预测指数
讨论
分析挥发性化合物中的生物标志物模式是疾病诊断研究中的一个新兴领域。在本研究中，我们分析了健康奶牛、临床乳腺炎奶牛和由不同病原体引起的亚临床乳腺炎奶牛的牛奶样本中的挥发性化合物。从e-Nose收集的数据使用了PCA、OPLS-DA、RF、SVM、KNN和PNN进行处理。这项研究表明了
结论
本实验展示了e-Nose技术在诊断奶牛亚临床乳腺炎和识别其三种致病微生物方面的潜力。感染病原微生物的亚临床乳腺炎奶牛的牛奶VOCs响应值发生了显著变化。我们的发现还揭示了病原菌代谢物的变化，并表明牛奶中鉴定出的一些不同代谢物可能是这三种疾病的潜在诊断生物标志物
作者贡献声明
王芳：撰写——初稿，正式分析，数据管理，概念构思。
朱玉军：撰写——初稿，正式分析，数据管理，概念构思。
张恩秋：方法学，研究，正式分析。
张荣：软件，方法学，研究。
段宏伟：撰写——审稿与编辑，验证，监督，软件。
杨帅：验证，监督，软件，数据管理。
杜向红：监督，软件，资源。
赵兴旭：撰写——
资助
本研究由甘肃省研发与预警科学技术部门资助（21JR7RA858）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢甘肃农业大学兽医学院和甘肃动物世代生理与生殖调控重点实验室提供实验设备。同时感谢Mjeditro（www.mjeditor.com）提供的英语语言编辑服务以及上海Bioprofile技术有限公司的技术支持。
