《Food Chemistry》：Improved physicochemical, interfacial and digestive properties of emulsions containing whey protein concentrate produced by ultrasound and enzymatic glycosylation with arabinoxylan
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乳清蛋白浓缩物（WPC）经超声预处理结合漆酶催化阿拉伯木聚糖（AX）共价键合，优化质量比3:2，形成致密三维网络结构的WPC-AX复合物，显著提升溶解性、乳化性和HIPEs稳定性，粒径更小且耐胃消化。
王一叶|王彤|王宇|奥拉耶米·埃伊图约·杜杜|于电宇|程金菊
教育部乳品科学重点实验室，东北农业大学，哈尔滨，黑龙江省150030，中国
摘要
在本研究中，结合使用超声波处理和由漆酶诱导的阿拉伯木聚糖（AX）的酶促共价键合技术，对乳清蛋白浓缩物（WPC）的构象和功能特性进行了改性，并探讨了其对高内相乳液（HIPEs）的影响。结果表明，通过表征确定AX与WPC的最佳共价反应质量比为3:2，对WPC进行10分钟的超声波预处理有助于形成WPC-AX结合物，并改善其溶解性和乳化性能。WPC-AX结合物能够快速附着在油水界面，形成更加致密的三维网络结构。这种结构的形成可以减缓被包裹油滴的氧化速率。由WPC-AX结合物形成的HIPEs表现出更小的滴粒尺寸、均匀的微观结构、以弹性为主的特点，并且在胃消化过程中具有显著提高的表观粘度及更好的稳定性。
引言
高内相乳液（HIPE）是一种结构特殊的浓缩乳液系统，系统中超过74%的空间被内相占据（Kan等人，2023年）。由于其良好的流变性能，它在食品、化妆品和材料科学领域有广泛的应用。较高的油相含量使得表面活性剂的选择变得更加复杂（Zhao等人，2025年）。目前，蛋白质因其良好的乳化和界面特性而被认为是稳定HIPE的理想乳化剂。然而，单一蛋白质形成的界面膜机械强度较低，难以支撑高内相乳液的凝胶网络结构（Jiang等人，2023年）。因此，选择安全稳定的物质作为高内相乳液的乳化剂已成为一个热门研究课题。
乳清蛋白是乳制品加工的副产品，约占牛奶蛋白的18%-20%（Du、Zhou等人，2022年）。目前，乳清蛋白分离物（WPI）和乳清蛋白浓缩物（WPC）是其主要产品。乳清蛋白因其富含必需氨基酸而备受推崇（Baba等人，2021年）。WPC常被用作饮料、烘焙食品和婴儿配方中的添加剂和功能性成分，因其出色的乳化、发泡和稳定性能（Wagner等人，2020年）。然而，蛋白质的结构和性质会受到加工条件变化的影响（如温度、pH值或离子混合物的变化）。某些条件变化可能会促进蛋白质聚集，甚至导致乳清蛋白沉淀，从而影响其功能和营养价值。因此，有必要通过某些改性措施来改善WPC的功能特性。
如今，酶促交联和超声波技术在食品工业中受到了广泛关注。酶促交联是一种高效、快速且安全的方法，而高强度超声波处理则被认为是一种简单、温和且环保的过程。这两种方法都能改变蛋白质的结构并提升其功能特性。研究表明，在特定反应条件下，蛋白质-多糖结合物表现出增强的功能特性，包括乳化能力、热稳定性、抗氧化活性和抗菌活性（Liu等人，2016年）。阿拉伯木聚糖（AX）是一种主要存在于谷物（如水稻、小麦、玉米、高粱和大麦）外层和胚乳细胞壁中的非淀粉多糖（Izydorczyk & Biliaderis，1995年）。AX主要由D-己基吡喃糖组成，通过β-(1–4)糖苷键连接到主链上，α-L-阿拉伯呋喃糖取代AX的C(O)-2/C(O)-3位置。在酶的作用下，侧链中的阿魏酸（FA）与蛋白质结合形成复合物（Gao等人，2023年）。漆酶（LAC）是一种多铜氧化还原酶，通过单电子氧化机制利用氧气作为电子受体来氧化酚羟基。漆酶可导致蛋白质聚集和水的生成（Mate & Alcalde，2016年）。蛋白质中的酪氨酸基团在漆酶的作用下与AX侧链上的FA交联形成AX蛋白结合物（Lv等人，2022年）。共价接枝的多糖可以为蛋白质提供空间位阻，使结合物具有不同于原始蛋白质的特性。Hong等人（2021年）发现，由WPI和右旋糖酐结合物稳定的纳米乳液在多种pH值、温度和离子浓度条件下表现出更好的稳定性。这一发现表明，糖基化改性可以增强WPI的空间和静电排斥作用。然而，球状蛋白质的紧密结构限制了漆酶催化的蛋白质反应。为了解决这一问题，可以通过超声波处理改变蛋白质的结构，从而促进糖基化反应。超声波技术是一种新兴技术，可以利用高机械能和剪切力处理生物聚合物（Chavan等人，2022年）。它可以通过空化作用导致生物聚合物的降解和解聚，从而改变其结构、物理和功能特性（Cui & Zhu，2021年）。Li等人（2022年）采用美拉德反应对卵转铁蛋白/黄原胶混合物进行了超声波辅助糖基化处理，发现适当的超声波处理（20分钟）有利于改善泡沫形成和溶解性，而过度的超声波处理（40分钟）则会产生不利影响。尽管一些研究表明超声波处理与美拉德反应结合使用可以改善蛋白质的功能特性，但关于超声波处理与酶促糖基化结合使用的文献较少。目前尚不清楚超声波预处理时间对酶促糖基化反应的影响。因此，在本研究中，WPC在与其他多糖和酶促糖基化结合前先进行了不同时间的超声波预处理，期望通过超声波预处理暴露更多的反应位点，从而增强后续酶促糖基化过程中的共价反应程度。本研究旨在探讨超声波处理与酶促糖基化结合对WPC构象和功能特性的影响，并利用改性后的蛋白质作为HIPE的乳化剂，探索其在乳液应用中的性能。
本研究的具体研究过程如下：首先，通过325 nm和280 nm处的吸光度值、巯基含量、荧光强度和FTIR分析筛选AX与WPC的最佳反应比例；通过比较粒径、电位和FTIR分析验证了分子间交联的存在；其次，研究了不同超声波预处理时间对WPC与AX在最佳质量比下酶促糖基化的作用，以增强WPC的功能特性；最后，使用经过最佳超声波预处理的蛋白质作为HIPE的水相，进一步研究了改性WPC对HIPE的乳化效果，通过检测粒径、Zeta电位、流变学、油脂氧化及消化特性等指标进行评估。该研究为WPC的改性方法提供了新的途径，从而扩展了WPC-AX结合物的应用范围。
材料
乳清蛋白浓缩物（WPC，蛋白质含量80%，乳糖5%，脂肪6.5%，矿物质3%）购自Hilmar公司（美国）。漆酶（LAC，500 U/g）购自北京Biotopped Technology公司（北京，中国）。阿拉伯木聚糖（AX，纯度98%）购自西安恩肽生物技术有限公司（西安，中国）。本研究中使用的其他化学试剂和溶剂均为分析级。
WPC-AX结合物的制备和最佳质量比选择
将WPC（2.0 g/100 g）与磷酸钠缓冲液（10 mmol，pH 7.4）搅拌3小时，制备WPC分散液
紫外-可见光谱表征
WPC中的酪氨酸和AX中的阿魏酸的特征吸收峰分别位于280 nm和325 nm（Wang等人，2020年；Wu等人，2022年）。芳香族氨基酸与阿魏酸之间的相互作用可能会改变紫外吸收色素的微环境，从而降低紫外吸收（Milio等人，2022年）。为此，我们通过监测325 nm和280 nm处的紫外吸收强度来评估WPC/AX混合物和WPC-AX结合物的接枝情况。
结论
本研究提供了关于超声波处理与酶促糖基化结合用于改性WPC构象和功能特性的有益见解。在本研究中，WPC在以最佳共价反应质量比与漆酶诱导的AX结合前先进行了不同时间的超声波预处理。研究了不同超声波预处理时间对WPC结构和性质的影响。
作者贡献声明
王一叶：撰写初稿、方法学设计、实验研究。
王彤：数据分析与形式化分析。
王宇：数据验证与整理。
奥拉耶米·埃伊图约·杜杜：软件支持。
于电宇：研究监督与概念构思。
程金菊：撰写、审稿与编辑、资金申请。
未引用参考文献
Ellman和Lysko，1979
Li等人，2024
Wang等人，2025
Zhao Li等人，2024
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了黑龙江省自然科学基金（项目编号YQ2023C020）、中国博士后科学基金资助项目（项目编号2023MD734140）、黑龙江省博士后科学基金（项目编号LBH-Z23075）、黑龙江省“双一流”学科协同创新成果项目（项目编号LJGXCG 2023-060）以及乳品科学重点实验室开放研究基金的支持。
